文章標題：Mechanism study of phthalate exposure promoting endometriosis: Based on the ferroptosis perspective

文章主題：鄰苯二甲酸酯（PAEs）暴露促進子宮內膜異位癥（EM）的機制研究

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials

影響因子：11.3

組學技術：單細胞轉錄組、空間轉錄組、Bulk RNA-seq

研究背景

鄰苯二甲酸酯（PAEs）是廣泛存在的環(huán)境內分泌干擾物，可通過多途徑暴露并與子宮內膜異位癥（EM）發(fā)病風險相關，但具體分子機制尚不明確；鐵死亡是 EM 的關鍵病理過程，而 PAEs、鐵死亡與 EM 三者間的關聯(lián)研究仍不足，本研究旨在從鐵死亡視角系統(tǒng)揭示 PAEs 暴露促進 EM 發(fā)生發(fā)展的分子機制。

研究路線

圖1.分析流程圖

研究結果

1.?篩選鄰苯二甲酸酯暴露下子宮內膜異位癥中差異表達的鐵死亡相關基因

首先從ChEMBL、CTD、SwissTargetPrediction及PharmMapper數據庫共獲取5325個鄰苯二甲酸酯（PAEs）靶點，從 GeneCards、OMIM、TTD及DrugBank數據庫獲得2440個子宮內膜異位癥（EM）相關靶點，二者交集得到929個PAEs-EM預測靶點。隨后以GSE51981數據集（71例正常樣本、77例EM樣本）為訓練集，識別出2370個差異表達基因（DEGs），含1199個上調基因、1171個下調基因。加權基因共表達網絡分析（WGCNA）將基因劃分為10個模塊，其中綠松石模塊與EM相關性最高，該模塊基因與DEGs交集得到2215個EM相關差異基因。最后將上述基因與鐵死亡數據庫（FerrDb）中的鐵死亡相關基因（FRG）取交集，篩選出10個在PAEs暴露下EM中差異表達的鐵死亡相關基因（PAEs/EM-FRG）。

圖2. PAE/EM-FRG的鑒定

2.?PAEs/EM-FRG富集于氧化應激與上皮-間質轉化相關通路

上述10個核心基因（TFAM、TGFB1、ARF6、EZH2、HSPA5、JUN、AKR1C3、MAPK3、PIK3CA、SLC11A2）均為PAEs作用靶點且兼具EM相關表達特征與鐵死亡屬性，基因間存在共表達模式，共同參與EM進展中的鐵死亡調控。GO富集分析顯示，這些基因主要富集于活性氧應答、氧化應激反應、上皮-間質轉化（EMT）正向調控、上皮細胞遷移、干細胞發(fā)育等通路；KEGG 分析則提示其與鐵死亡、子宮內膜癌、孕激素介導的卵母細胞成熟等過程密切相關。

圖3. PAE/EM-FRG富集的功能通路研究

3.?ARF為鄰苯二甲酸酯暴露下的關鍵鐵死亡相關基因

為篩選PAEs暴露下促進EM的核心基因，本研究采用12種機器學習算法（XGBoost+Lasso+RF最優(yōu)組合）對PAEs/EM-FRG進行篩選。Lasso算法篩選出8個候選基因，隨機森林（RF）篩選出5個，XGBoost篩選出4個，三者交集僅ARF6。進一步對5例EM患者與5例正常女性子宮內膜組織進行免疫組化（IHC）與免疫熒光（IF）驗證，結果顯示EM組織中ARF6表達顯著高于正常組織，證實ARF6是PAEs暴露下驅動 EM 的關鍵鐵死亡相關基因。

圖4.采用多種機器學習算法識別暴露于PAEs的樞紐FRG

4.?ARF6 在子宮內膜異位癥中與上皮-間質轉化相關細胞共定位

單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析顯示，正常樣本以上皮細胞（Epi）為主，EM樣本中間質細胞（MSCs）占比更高，符合EMT特征。單細胞水平證實ARF6在Epi與MSCs中均有表達；免疫熒光共定位實驗顯示：正常組織中ARF6與上皮標志物EPCAM共定位、低表達，EM組織中ARF6與間質標志物COL1A1共定位、高表達（圖 5G），提示ARF6表達與定位轉變直接驅動EMT。

圖5. 單細胞轉錄組分析

5.?ARF6 表達與上皮細胞干性正相關

將上皮細胞分為SOX9、腔上皮（Lumenal）、腺上皮、纖毛上皮（Ciliated）4個亞型，正常組織以腔上皮、纖毛上皮為主，ARF6主要在腔上皮、腺上皮中表達。CytoTRACE干性分析證實腔上皮、纖毛上皮干性最強，且ARF6表達與二者干性呈顯著正相關，提示ARF6通過增強上皮細胞干性促進EMT。

圖6. 上皮細胞亞群注釋與CytoTRACE分析

6.?間質細胞具有高上皮-間質轉化能力

將間質細胞分為子宮內膜基質細胞（EnS）、成纖維細胞（Fibros）、平滑肌細胞（SMCs）3個亞型，EM組織中成纖維細胞占比最高，ARF6主要在成纖維細胞中高表達。基因集變異分析（GSVA）顯示，成纖維細胞EMT能力最強，為EMT的關鍵效應細胞。

圖7. 間充質干細胞亞群注釋與GSVA分析

7.?ARF6介導上皮-間質轉化、促進成纖維細胞分化

擬時序分析證實：正常組織的腔上皮、纖毛上皮可定向分化為EM組織中的成纖維細胞，完成EMT過程。隨偽時間進展，成纖維細胞EMT標志物（CDH2、SNAI1）表達逐漸升高，且ARF6表達與CDH2、SNAI1水平呈顯著正相關；免疫熒光證實ARF6與CDH2在EM組織中共定位，直接證明ARF6驅動成纖維細胞分化、促進EMT。

圖8. Epi/MSC亞群擬時序分析

8.?空間轉錄組聯(lián)合免疫熒光驗證子宮內膜異位癥中的上皮-間質轉化

空間轉錄組顯示，EM組織中上皮標志物CDH1下調、間質標志物CDH2上調，發(fā)生鈣粘蛋白轉換（EMT典型特征）。免疫熒光證實：正常組織中ARF6與上皮標志物CDH1共定位；細胞通訊分析顯示，TGFβ、WNT、NOTCH通路及IL6信號在腔上皮與成纖維細胞間介導關鍵互作；空間距離分析證實腔上皮與成纖維細胞空間位置最近，擬時序分析進一步支持二者定向分化關系，從空間維度證實ARF6介導的EMT。

圖9. 空間轉錄組學與免疫熒光共定位

9.?ARF6敲除模擬揭示其對鐵死亡的調控網絡

采用scTenifoldKnk算法對EM成纖維細胞進行ARF6虛擬敲除，發(fā)現23個鐵死亡相關基因表達顯著改變，功能富集顯示這些基因參與氧化應激應答、蛋白磷酸化調控、細胞黏附、傷口愈合等過程，證實ARF6通過調控鐵死亡相關通路，介導EMT過程中的鐵死亡。

圖10. ARF6虛擬敲除后的通路變化

10.?鄰苯二甲酸酯與關鍵鐵死亡靶點ARF6的分子對接

分子對接結果顯示，7種常見 PAEs（DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP、DiNP、DOP）與ARF6結合能均＜-5 kcal/mol，結合親和力強，證實PAEs可直接結合并激活ARF6，啟動下游致病通路。

圖11. 分子對接結果

結論與意義

綜上所述，本研究將ARF6確定為PAEs暴露下的關鍵FRG蛋白，并從多維度論證了其在子宮內膜異位癥（EM）發(fā)病機制中的重要作用。尤為重要的是，我們構建了EM中“管腔細胞+纖毛細胞→纖維化”的EMT轉化模型，將EMT研究的重點從“混合細胞”轉向“特定亞型細胞”。通過整合PAEs與EM之間的作用網絡，本研究提出了“PAEs-鐵死亡-EMT-子宮內膜異位癥”軸，并揭示了ARF6在此過程中的中介作用，從而將環(huán)境暴露促進疾病發(fā)展的理論從“宏觀關聯(lián)”提升至“微觀機制”層面。這些發(fā)現不僅基于“AEs-EM”軸為EM提供了新的治療靶點，更為EM的防治提供了環(huán)境暴露預防的新視角。