這期推文的封面是一張富集分析的網(wǎng)絡(luò)圖，來自文獻(xiàn)：Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations，算是比較新穎的富集展示方法，是用Cytoscape做的。

之前我介紹過一個(gè)網(wǎng)頁工具，可以做富集結(jié)果的網(wǎng)絡(luò)圖，這篇推文的閱讀量已經(jīng)是我的小破公眾號關(guān)注人數(shù)的兩倍多，可以看出大家對這個(gè)很感興趣。這一期，我繼續(xù)介紹這種網(wǎng)絡(luò)圖，用到的是Cytoscape，比之前的網(wǎng)頁工具可定制程度更高。主要參考的protocol來自文獻(xiàn)：Pathway enrichment analysis and visualization of omics data using g:Profiler, GSEA, Cytoscape and EnrichmentMap。

公眾號后臺回復(fù)20210401獲取這篇protocol，以及測試數(shù)據(jù)。
這篇文獻(xiàn)除了寫富集可視化，還寫了如何做富集分析、GSEA，考慮相當(dāng)周到，通讀全文可以發(fā)現(xiàn)不少知識點(diǎn)，滿滿都是干貨，比如

1. 做GSEA時(shí)，不需要對基因做過濾
2. Biological process是最常用的GO注釋
3. 做GSEA時(shí)，需要對基因排序，排序的標(biāo)準(zhǔn)可以是一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)的結(jié)合，比如log-transformed fold-change，?log10 P value multiplied by the sign of log-transformed fold-change
4. 將冗余的通路合并到單個(gè)生物主題能簡化后續(xù)的解釋。這種網(wǎng)路圖就是這個(gè)目的，每一個(gè)通路是一個(gè)圓點(diǎn)，兩個(gè)通路之間共享很多基因的話會(huì)用線連起來，共享基因數(shù)目越多，線越粗

...

什么是Cytoscape？
Cytoscape是一個(gè)開源軟件平臺，主要用于分子互作網(wǎng)絡(luò)和生物通路的可視化，以及將這些網(wǎng)絡(luò)與注釋信息，基因表達(dá)譜整合起來。 盡管Cytoscape最初是為生物學(xué)研究而設(shè)計(jì)的，但現(xiàn)在它是進(jìn)行復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析和可視化的通用平臺。

當(dāng)我打開官網(wǎng)的時(shí)候，我驚呆了，真的太好看了！

這篇protocol中，對于整個(gè)基因富集過程分了三步

1. 使用組學(xué)數(shù)據(jù)定義目標(biāo)基因列表
2. 通路富集分析：過濾后的基因集（比如找差異基因，就是要過濾的，工具 g:Profiler，當(dāng)然我們都很熟的clusterProfiler也是可以的）；不過濾要排序的基因集（比如做GSEA）。這一步之后就能得到富集到的通路以及對應(yīng)的顯著性
3. 通路富集分析結(jié)果的可視化和解釋

我主要演示最后一步，只要兩個(gè)文件：
一個(gè)包含富集結(jié)果的文件；
一個(gè)是在做富集時(shí)，用到的參考文件，比如GO BP文件，gmt格式

電腦要求8G內(nèi)存

1 GB of RAM is sufficient to run GSEA
analysis; however, Cytoscape (required to run EnrichmentMap software) requires ≥8 GB of RAM.

軟件及插件安裝

下載地址：https://cytoscape.org/download.html
cytoscape的安裝很容易

安裝4個(gè)插件：
EnrichmentMap, v.3.1 or higher; clusterMaker2, v.0.9.5 or higher; WordCloud, v.3.1.0 or higher; AutoAnnotate, v,1.2.0 or higher.
打開Cytoscape點(diǎn)擊上方的APP菜單欄，Apps → App Manager，在新窗口搜索這四個(gè)插件，找到后點(diǎn)擊這個(gè)插件，然后點(diǎn)擊右下角的"Install"即可安裝?？梢栽谛麓翱诘?Currently Installed"菜單查看是否已經(jīng)安裝成功。

演示

文獻(xiàn)原文同時(shí)介紹了GSEA富集的網(wǎng)絡(luò)圖，步驟基本一樣。另一方面，做GSEA一般會(huì)挑基因集去做，基因集不會(huì)很多，這種網(wǎng)絡(luò)圖可能還沒有GSEA經(jīng)典圖用得多。所以我用找差異基因過濾后的基因集做演示。

打開軟件之后，首先打開EnrichmentMap，按照圖示箭頭依次輸入

新窗口按照圖示導(dǎo)入需要的文件和參數(shù)

注意在表型這一欄，我填入了兩個(gè)相反的表型，文獻(xiàn)提供的GO富集結(jié)果只有一種表型，因此可以不填。

點(diǎn)擊build，可以得到如下結(jié)果，

整體上看，框架已經(jīng)有了，接下來做一些調(diào)整
鼠標(biāo)點(diǎn)擊圖中的每一個(gè)節(jié)點(diǎn)，選中的節(jié)點(diǎn)會(huì)變?yōu)辄S色，這時(shí)我們可以隨意拖拽節(jié)點(diǎn)到新的位置。在按住"Ctrl"鍵的同時(shí)，鼠標(biāo)左鍵畫矩形，可以同時(shí)選中多個(gè)節(jié)點(diǎn)和多個(gè)連邊，這時(shí)可以一起拖拽。
最左邊的是EnrichmentMap插件的控制窗口，Node Cutoff調(diào)整p值，越嚴(yán)格，圖形中剩下的節(jié)點(diǎn)越少；Edge Cutoff可以調(diào)整節(jié)點(diǎn)之間是否顯示連線，值越大，則更相似的節(jié)點(diǎn)才會(huì)連線。

接下來，我們將兩種表型分開，一個(gè)放左邊，一個(gè)放右邊，盡管我這個(gè)圖左右分得比較好，手動(dòng)拖拽節(jié)點(diǎn)，幾下也能分開，但不排除會(huì)遇到兩種表型的通路分不太開的情況。
我們首先需要點(diǎn)擊最左側(cè)的"Filter"菜單，然后點(diǎn)擊"+"號，選擇"Column filter"，

選擇這個(gè)NES開頭的選項(xiàng)

我們在最開始設(shè)置表型時(shí)，positive設(shè)置為處理組，軟件會(huì)把處理組的NES都設(shè)為1，對照組設(shè)為-1。在新窗口將范圍調(diào)為0到1，這里的0-1選擇的就是處理組；-1到0是未處理組。

選中的節(jié)點(diǎn)都變成了黃色，拖動(dòng)它們至左邊位置。

接下來對這些選中的節(jié)點(diǎn)，重新排布

處理組節(jié)點(diǎn)新的布局不一定合適，有時(shí)候還是需要手動(dòng)調(diào)整節(jié)點(diǎn)的位置，所以重新排布這一步也不是必須的，Ctrl+z可以撤銷操作。

之后我們把過濾范圍設(shè)為-1到0，對照組做同樣的調(diào)整，

我們從上圖可知一些共享較多基因的通路會(huì)聚在一起，它們往往功能也比較相似。接下來我們用AutoAnnotate插件將cluster畫圈以及總結(jié)出cluster的大致功能（這一步是根據(jù)通路名稱的詞頻得出的）。

在新窗口點(diǎn)擊開始即可

新的圖形是這樣的，同時(shí)右上角出現(xiàn)的新面板可以調(diào)整圖中的橢圓外形。

多數(shù)情況下，這些cluster的名稱需要人工矯正。如下圖，點(diǎn)擊名稱后，鼠標(biāo)右鍵：

另一方面，每個(gè)圓圈內(nèi)的通路名稱，也可以去掉

在EnrichmentMap的控制窗口點(diǎn)擊"Publication ready"

圖示圓圈比較密集，我們可以調(diào)整左下角Layout Tools的scale這一條

新的圖是這樣的

進(jìn)一步做一些微調(diào)，

接下來就可以保存文件了
如下，保存為pdf

當(dāng)然也可以另存為cytoscape(cys)文件，方便下次接著繪制

好啦，這篇推文就到這里。整理不易，若這篇推文對您有所幫助，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)，謝謝！

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