在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究中，液體樣本（支氣管肺泡灌洗液、腹水、胸腔積液、腦脊液）具有無創(chuàng)或微創(chuàng)、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測、反映局部微環(huán)境等獨(dú)特優(yōu)勢。然而，這類樣本因細(xì)胞數(shù)量少、活性難維持、雜質(zhì)干擾多，從離體的那一刻起，就進(jìn)入了一場與時(shí)間的賽跑。
實(shí)驗(yàn)室的處理能力固然重要，但樣本質(zhì)量的“天花板”，往往在采樣后的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)就已注定。作為一家專業(yè)的科研服務(wù)公司，我們深知：老師在采樣、運(yùn)輸、保存環(huán)節(jié)的每一個(gè)規(guī)范操作，都是后續(xù)高質(zhì)量數(shù)據(jù)的最強(qiáng)保障。
本文將為您拆解四類液體樣本的采樣與保存核心要點(diǎn)，幫助您從源頭規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)，讓每一管樣本都能“合格入場”。
一、液體樣本離體后，最脆弱的30分鐘會(huì)發(fā)生什么？
細(xì)胞活性斷崖式下跌：中性粒細(xì)胞、間皮細(xì)胞在離體后2小時(shí)內(nèi)，活性可從90%降至30%以下。
細(xì)胞聚集與黏液形成：肺泡灌洗液中的黏液蛋白、腹水中的纖維蛋白原會(huì)迅速纏繞細(xì)胞，形成無法分散的團(tuán)塊。
酶解與氧化應(yīng)激：炎性樣本中含有大量蛋白酶、DNA酶，可降解細(xì)胞表面標(biāo)志物和RNA。
細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)：體液（尤其腹水、灌洗液）可能攜帶細(xì)菌，常溫下會(huì)快速繁殖并裂解細(xì)胞。
因此，此類液體樣本質(zhì)量的好壞，80%取決于離體后第一個(gè)小時(shí)的處理方式。下面我們按樣本類型，逐一給出各位老師可執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)操作。
二、四大液體樣本的“操作自查清單”
樣本1：腹水 / 胸腔積液
【老師必做事項(xiàng)】
采集管：使用EDTA抗凝管（紫色蓋），每10mL樣本額外加入100μL的BSA（10%）或胎牛血清（FBS）。
常見錯(cuò)誤：使用肝素鈉管（干擾后續(xù)反轉(zhuǎn)錄）或無抗凝管（易凝集）。
記錄外觀：拍照記錄液體顏色：清亮、血性、乳糜狀（牛奶樣）。
常見錯(cuò)誤：忽略記錄，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室處理策略延誤。
運(yùn)輸溫度：4-8℃ 環(huán)境進(jìn)行保存運(yùn)輸，嚴(yán)禁冷藏。
常見錯(cuò)誤：放入4℃冰箱（低溫可致腫瘤細(xì)胞、間皮細(xì)胞凋亡）。
運(yùn)輸時(shí)限：6小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。
常見錯(cuò)誤：超過8小時(shí)未處理且未添加保護(hù)液。
避免操作：禁止離心、禁止冷凍、禁止加任何固定液。
常見錯(cuò)誤：現(xiàn)場離心后棄上清，只送細(xì)胞沉淀（細(xì)胞干死）。
【特別提醒——乳糜性腹水】若腹水呈“牛奶樣”，說明含有大量脂肪顆粒。這些脂肪會(huì)包裹細(xì)胞，導(dǎo)致后續(xù)無法染色和分離。老師無需自行處理，但務(wù)必在采樣管上標(biāo)注“乳糜樣”，并在運(yùn)輸箱內(nèi)附上備注。
樣本2：腦脊液 —— “寸土寸金”的終極考驗(yàn)
【老師必做事項(xiàng)】
采集管：使用低吸附聚丙烯管（如Eppendorf LoBind），不可用普通EP管。
常見錯(cuò)誤：使用普通EP管（細(xì)胞吸附率可高達(dá)60%）。
抗凝：不可加肝素（腦脊液細(xì)胞極少，無需抗凝）。
常見錯(cuò)誤：加入肝素（干擾反轉(zhuǎn)錄酶）。
運(yùn)輸溫度：4~8℃（冰袋包裹，但不可直接接觸冰塊以防冰晶）。
常見錯(cuò)誤：室溫放置超過2小時(shí)。
運(yùn)輸時(shí)限：2小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。
常見錯(cuò)誤：超過4小時(shí)（細(xì)胞活性通常降至40%以下）。
避免操作：嚴(yán)禁渦旋、嚴(yán)禁劇烈搖晃、嚴(yán)禁加入任何液體。
常見錯(cuò)誤：試圖離心富集（老師離心極易損傷細(xì)胞）。
【特別提醒——細(xì)胞數(shù)量極少時(shí)】腦脊液正常細(xì)胞數(shù)<5個(gè)/μL，即使病理狀態(tài)也常<5000個(gè)細(xì)胞。老師無需自行計(jì)數(shù)，只需完整采集全部腦脊液（通常5~10mL），原管運(yùn)輸即可。由于細(xì)胞數(shù)量極少，細(xì)胞離體后凋亡快，建議上門做前處理并上機(jī)。
樣本3：支氣管肺泡灌洗液（BALF）—— 黏液的“世紀(jì)難題”
【老師必做事項(xiàng)】
采集容器：使用無內(nèi)毒素的無菌聚丙烯瓶或50mL離心管。
常見錯(cuò)誤：使用玻璃瓶（細(xì)胞易貼壁）。
即刻添加保護(hù)劑：采集后立即加入DNase I至終濃度10μg/mL，EDTA至終濃度1mM，5%-10%體積比的FBS進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)。
常見錯(cuò)誤：不加任何試劑，導(dǎo)致黏液凝集成團(tuán)。
運(yùn)輸溫度：4~8℃。
常見錯(cuò)誤：室溫（黏液蛋白加速交聯(lián)）。
運(yùn)輸時(shí)限：8小時(shí)內(nèi)送達(dá)。
常見錯(cuò)誤：隔夜處理。
避免操作：禁止冷凍、禁止渦旋、禁止過篩。
常見錯(cuò)誤：老師自行過濾（會(huì)丟失大量細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞）。
【特別提醒——黏液嚴(yán)重時(shí)】某些肺部疾?。ㄈ鐗m肺、哮喘）的BALF會(huì)呈“果凍樣”。老師只需在采集后加入DNase和EDTA，輕柔顛倒混勻，不可強(qiáng)行吹打或過篩。實(shí)驗(yàn)室收到后會(huì)采用DTT溫和消化，專業(yè)處理。
液體樣本的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，成功的第一責(zé)任人是采樣者。
您的每一個(gè)規(guī)范細(xì)節(jié)——從采集管的選擇，到運(yùn)輸溫度的確認(rèn)——都會(huì)直接體現(xiàn)在最終的數(shù)據(jù)質(zhì)量上。
如果您計(jì)劃開展液體樣本的單細(xì)胞測序，歡迎提前聯(lián)系我們。我們會(huì)為您提供專屬操作指南，并安排技術(shù)顧問隨時(shí)解答疑問。
讓我們攜手，把每一滴珍貴的臨床液體，都變成高質(zhì)量的科學(xué)數(shù)據(jù)。
