生物樣品中代謝物的測定方法有很多種，一般可分為直接定量法、代謝產(chǎn)物水解后通過母體藥物間接定量法或利用藥物與其代謝物之間的響應因子定量法。
直接定量法
直接定量法是測定生物樣品中代謝物的最合適方法，但需要考慮以下兩點：
[if !supportLists]1.?[endif]一般情況下，代謝物比母體藥物更具親水性，尤其是葡萄糖醛酸。這使得直接測定代謝物的難度加大，因為大多數(shù)情況下，這些極性分析物和干擾基質(zhì)成分之間是無法實現(xiàn)色譜分離的。然而，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的出現(xiàn)克服了這一問題，它可以實現(xiàn)代謝物的直接定量。由于LC-MS/MS具有快速、特異性強、靈敏度高等特點，在藥代動力學和代謝研究中發(fā)揮著重要作用。
[if !supportLists]2.?[endif]生物樣品中代謝物定量的可靠性和準確性需要合適的對照標準物質(zhì)。在分析方法的驗證中，使用合適的對照標準物質(zhì)在給定的生物樣品中制備校準和對照樣品。一些代謝物標準品通常在市場上無法買到，尤其是新藥或濫用藥物的情況。此外，現(xiàn)有的代謝物標準品可能非常昂貴，因此并非每個研究小組都能獲得，尤其是學術(shù)領(lǐng)域。在使用LC-MS/MS分析時，推薦使用穩(wěn)定同位素標記的代謝物標準品，但其可能比未標記的代謝物更貴。
這時候，有人可能會問：為什么不根據(jù)母體藥物的標準曲線來定量代謝物的濃度？因為這個標準曲線是隨時可以獲得的。在不同的液相色譜檢測系統(tǒng)中，代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的改變會對檢測結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。即使結(jié)構(gòu)變化很小，采用大氣壓電離源進行質(zhì)譜分析也很容易出現(xiàn)這一問題。有報道稱，兩種化學式相同的氧化異構(gòu)體代謝物在ESI-MS中的響應因因子不同，或在ESI的正離子模式中未檢測到與母體藥物不同信號，只有在負離子模式下才檢測到這些化合物。有時代謝物與母體藥物具有相同的發(fā)色團，則一般不使用紫外檢測。但這項技術(shù)在藥代動力學研究中的主要局限性在于靈敏度和選擇性太低，因為某些代謝物在波長處沒有紫外吸收，無法將其與背景區(qū)分開來。如果使用電化學檢測，其響應也可能對代謝物的結(jié)構(gòu)有很大的依賴性，尤其是對于I相代謝物，與母體藥物相比，通常其氧化還原性發(fā)生了變化。此外，這兩類屬于選擇型檢測器，適用性有限.
在沒有合適標準的情況下，也可以進行直接定量。為此，檢測器需要給出所有目標化合物的摩爾響應值。此外，該檢測器應具有靈敏度高、動態(tài)范圍寬、堅固耐用和易與操作、與反相色譜梯度洗脫兼容、不易受基質(zhì)干擾等特性。雖然可以使用更高級的檢測器，但其中很少有可用于代謝物定量的。最近，F(xiàn)DA出臺了關(guān)于代謝物安全性測試的指南，該指南建議所有大于母體藥物10%的代謝物都應進行檢測，大家感興趣的話，可以去找來看看。
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參考資料：Roskar, Robert , and T. Trdan . Analytical Methods for Quantification of Drug Metabolites in Biological Samples. Chromatography - The Most Versatile Method of Chemical Analysis. 2012.
