文章題目：Platycodon grandiflorum exosome-like nanoparticles: the material basis of fresh platycodon grandiflorum optimality and its mechanism in regulating acute lung injury
文章主題：桔梗外泌體樣納米顆粒：鮮桔梗優(yōu)效性的物質(zhì)基礎(chǔ)及其調(diào)控急性肺損傷的作用機(jī)制
組學(xué)技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組+代謝組
研究背景
急性肺損傷（ALI）是一種死亡率高、臨床缺乏有效治療手段的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病，現(xiàn)有治療以支持治療為主，激素類(lèi)藥物存在明顯不良反應(yīng)。新鮮中草藥在抗炎等疾病防治中效果優(yōu)于干品，桔梗作為經(jīng)典止咳化痰、治療肺炎的中藥，現(xiàn)有研究多聚焦于炮制品或干品，其鮮品優(yōu)效的具體物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚不明確。而藥用植物源外泌體樣納米顆粒，為揭示鮮藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制提供了新方向，因此亟需明確鮮桔梗優(yōu)于干桔梗治療ALI的關(guān)鍵物質(zhì)，并闡明其調(diào)控肺損傷的分子機(jī)制。
研究路線(xiàn)
研究結(jié)果
1.?桔梗可改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺部病理?yè)p傷
本研究采用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）小鼠模型，探究新鮮桔梗與干燥桔梗在肺部抗炎效果上的差異，與預(yù)期結(jié)果一致，LPS 造模后小鼠出現(xiàn)顯著體重下降；組織學(xué)結(jié)果顯示，LPS 刺激可導(dǎo)致肺泡壁增厚、肺間質(zhì)水腫、肺泡出血、肺泡腔塌陷，且肺泡腔與肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示肺組織發(fā)生廣泛的結(jié)構(gòu)紊亂。新鮮桔梗提取物（PF）干預(yù)可顯著恢復(fù)小鼠整體狀態(tài)與肺部病理?yè)p傷，主要表現(xiàn)為體重下降緩解、肺組織結(jié)構(gòu)與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況改善。干燥桔梗提取物（PD）組對(duì)體重下降與肺組織炎性損傷也有一定改善作用，但組織學(xué)檢測(cè)仍可見(jiàn)肺泡出血、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及局部肺泡壁增厚（圖 1B、E）。同時(shí)，PF 與 PD 均可顯著降低 LPS 誘導(dǎo)的 ALI 小鼠肺泡灌洗液中總蛋白含量，表明新鮮桔梗與干燥桔梗均能有效減輕炎性滲出（圖 1C）。與之相符，PF 與 PD 均能顯著下調(diào) LPS 誘導(dǎo)小鼠肺組織中促炎因子白細(xì)胞介素 - 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6）和腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的 mRNA 表達(dá)水平（圖 1D）。本部分結(jié)果證實(shí)：新鮮桔梗與干燥桔梗均能減輕 LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷，可緩解體重下降、降低炎性滲出與促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平、改善肺泡壁增厚、水腫、出血及炎性浸潤(rùn)等病理?yè)p傷；且新鮮桔梗的修復(fù)與抗炎效果顯著優(yōu)于干燥桔梗。
2. 桔梗外泌體樣納米顆粒（PGLNs）的分離與表征
研究分別通過(guò)透射電鏡（TEM）、動(dòng)態(tài)光散射、納米顆粒跟蹤分析（NTA）、瓊脂糖凝膠電泳與十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），對(duì) PGLNs 的形態(tài)、Zeta 電位、粒徑及成分進(jìn)行系統(tǒng)分析與表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所提取的 PGLNs 符合外泌體樣納米顆粒的典型特征并具有良好的穩(wěn)定性與分散性。隨后，本研究對(duì) PGLNs 進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其富含多種多肽與蛋白質(zhì)，共鑒定出112 種蛋白組分；其中約 70% 的蛋白分子量在 0–80kDa 之間，約 30% 的蛋白分子量大于 80kDa。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，37 種蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，15 種蛋白定位于質(zhì)膜。GO 與 KEGG 分析表明，PGLNs 含有多種與膜組分相關(guān)的蛋白，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與多種代謝通路，進(jìn)一步證實(shí) PGLNs 的囊泡樣特征及其作為潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的屬性。
3. PGLNs 具有良好的生物相容性
為進(jìn)一步評(píng)價(jià) PGLNs 的生物相容性，并為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供安全性依據(jù)，本研究從血液相容性、巨噬細(xì)胞、斑馬魚(yú)胚胎、小鼠組織器官多個(gè)生物學(xué)層面開(kāi)展了毒理學(xué)檢測(cè)。均表現(xiàn)出低毒性、高生物相容性，可安全用于體內(nèi)給藥，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的安全基礎(chǔ)。
4. PGLNs 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的治療作用
構(gòu)建 LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型，通過(guò)尾靜脈注射 PGLNs進(jìn)行干預(yù)；觀(guān)察小鼠一般狀態(tài)、體重變化，檢測(cè)肺組織大體形態(tài)、肺泡灌洗液總蛋白、肺組織病理?yè)p傷（H&E）、促炎 / 抗炎因子 mRNA 水平，并用免疫熒光檢測(cè)肺組織巨噬細(xì)胞極化（CD86/M206）。結(jié)果顯示 PGLNs 可顯著改善模型小鼠體重下降，減輕肺組織充血水腫并降低肺泡灌洗液總蛋白水平；同時(shí)明顯緩解肺泡壁增厚、出血、塌陷及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，下調(diào) IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎因子 mRNA 表達(dá)并上調(diào) TGF-β1 水平；此外，PGLNs 還能抑制肺組織 M1 型巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn) M2 型極化，整體對(duì) LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷發(fā)揮顯著保護(hù)作用。
5. PGLNs 調(diào)控 RAW264.7 細(xì)胞的極化
接著構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥損傷模型，用 PKH67 標(biāo)記 PGLNs 與細(xì)胞共孵育觀(guān)察攝取情況，通過(guò) CCK8 確定 1 μg/mL LPS 用于構(gòu)建炎癥模型，再采用 RT-qPCR、細(xì)胞免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，探究 PGLNs 對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用。結(jié)果表明：RAW264.7 細(xì)胞可有效攝取 PGLNs；PGLNs 能改善 LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷，下調(diào)促炎因子 IL-1β、IL-6 及 M1 標(biāo)志物 iNOS、CD86 的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子 IL-10 及 M2 標(biāo)志物 Arg-1、CD206 的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也驗(yàn)證了這一調(diào)控趨勢(shì)。
6. PGLNs 調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的代謝組學(xué)分析
為更深入闡明 PGLNs 調(diào)控 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)及極化的機(jī)制，本研究采用 UPLC-MS 廣泛靶向代謝組學(xué)對(duì) RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，共鑒定出 1588 種代謝物；PCA 與 OPLS-DA 分析顯示，對(duì)照組、LPS 模型組及 LPS+PGLNs 組代謝譜顯著分離，模型驗(yàn)證可靠，聚類(lèi)分析也進(jìn)一步證實(shí)，PGLNs 可明顯改善 LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞代謝紊亂。
7. LPS 及 LPS + PGLNs 處理后 RAW264.7 細(xì)胞的差異代謝物分析
本研究結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)閾值與 VIP 值篩選差異代謝物，獲得 Con vs.LPS 組 594 種、LPS vs.LPS+PGLNs 組 287 種差異代謝物；PCA 與 OPLS-DA 顯示各組代謝譜顯著分離，聚類(lèi)與分類(lèi)富集分析表明兩組差異代謝物種類(lèi)分布不同；此外，對(duì)照組與 LPS 組、LPS 組與 LPS+PGLNs 組的差異代謝物 KEGG 富集氣泡圖顯示，LPS 的作用機(jī)制主要與嘌呤代謝、嘧啶代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝，以及泛酸和輔酶 A 生物合成相關(guān)；而 PGLNs 的調(diào)控差異主要與亞油酸代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成、甘油磷脂代謝及不飽和脂肪酸生物合成相關(guān)。綜上所述，以上結(jié)果表明?PGLNs 通過(guò)調(diào)控不同的代謝中間產(chǎn)物，改善 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞代謝異常。
8. PGLNs 治療 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥的潛在生物標(biāo)志物
為進(jìn)一步探究 PGLNs 干預(yù)后的代謝物變化，接著對(duì)鑒定出的所有差異代謝物進(jìn)行匯總，并分析了對(duì)照組與 LPS 組、LPS 組與 LPS+PGLNs 組之間的代謝物差異。在 OPLS?DA 模型中，將VIP 值＞1且t 檢驗(yàn) P 值＜0.05的變量判定為差異代謝物，共得到52 種差異代謝物，其中上調(diào) 27 種、下調(diào) 25 種。經(jīng) PCA、聚類(lèi)熱圖及差異分析驗(yàn)證，這些代謝物在 LPS 刺激后顯著異常，經(jīng) PGLNs 干預(yù)后均出現(xiàn)不同程度逆轉(zhuǎn)，其中 18 種基本恢復(fù)正常，D - 氨基葡萄糖差異倍數(shù)最為突出，整體表現(xiàn)出向?qū)φ战M水平回歸的趨勢(shì)，提示這些物質(zhì)可作為 PGLNs 改善 LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥的潛在生物標(biāo)志物。
9. PGLNs 改善 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵代謝物分析
本研究進(jìn)一步篩選出 13 種關(guān)鍵差異代謝物，通過(guò) MetaboAnalyst 4.0 和 KEGG 進(jìn)行通路分析發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵代謝物主要參與甘油磷脂代謝、維生素 B6 代謝、醚脂代謝、泛酸和 CoA 生物合成、多種氨基酸代謝及氨基糖和核苷酸糖代謝；結(jié)合代謝通路關(guān)聯(lián)圖分析表明，PGLNs 可能通過(guò)調(diào)控氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝與糖酵解通路影響巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而發(fā)揮緩解肺部炎癥的作用。
