以張鋒的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體為例：從Addgene數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索該質(zhì)粒的序列http://www.addgene.org/42230/，點(diǎn)擊 View all sequences，點(diǎn)擊
GenBank，即可下載該載體序列，結(jié)構(gòu)示意圖如下：
U6 是真核生物的一個(gè)III型基因，這里的U6不是基因，而是它的啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)啟動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄。
使用這個(gè)載體唯一需要修改的就是sgRNA中的guide sequence，即BbsI這個(gè)酶切位點(diǎn)中間的序列，也就是下方序列的藍(lán)色堿基。把這部分序列替換為你所要敲除的基因的一段序列即可，一般只要20bp。
那么怎么替換呢？
因?yàn)樘峁┝薆bsI的兩個(gè)酶切位點(diǎn)，所以替換就方便多了。
如果已經(jīng)得到靶基因的20nt的靶序列，接下來(lái)就該Clone Manger登場(chǎng)了。復(fù)制這20nt的序列（以AAGGACAAGGACTTCCTGGA序列為例），打開(kāi)Clone Manger，依次點(diǎn)擊菜單欄File-->>Import from Clipboard,導(dǎo)入序列后，在依次點(diǎn)擊Clone-->>Modify Ends-->>Custom，按如下添加堿基：
點(diǎn)擊左下方Sequence，出現(xiàn)帶有粘性末端的DNA鏈，它的正鏈和反鏈就是需要發(fā)給公司的引物（Primer），那怎么導(dǎo)出呢？
我們知道正鏈的方向就是5'—>3'，可以直接復(fù)制粘貼，那反鏈呢？
Copy完正鏈后，依次點(diǎn)擊Operations-->>Process Molecule-->>Invert molecule-->>OK，將其翻轉(zhuǎn)，即原來(lái)的正鏈變?yōu)樨?fù)鏈，原來(lái)的負(fù)鏈變?yōu)檎?，就可以直接?fù)制粘貼了。
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