2020/5/25 今天給大家?guī)硪黄狢ell 2019年的文章 "Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis" 的全文翻譯，后續(xù)我會復現(xiàn)全文并公開代碼，歡迎關注！
重要縮寫：
（1）DE gene：differentially expressed gene，差異表達基因
（2）CAFs：cancer-associated fibroblasts，癌癥相關成纖維細胞
（3）IAFs：inflammation-associated fibroblasts，炎癥相關成纖維細胞
（4）Mcell：Microfold (M) cells，微折疊樣細胞
（5）CRC：結(jié)直腸癌
（6）UC：Ulcerative Colitis，潰瘍性結(jié)腸炎
Intra- and Inter-cellular Rewiring of the Human Colon during Ulcerative Colitis
人類結(jié)腸在潰瘍性結(jié)腸炎期間出現(xiàn)了細胞內(nèi)與細胞間的重構(gòu)
全文邏輯結(jié)構(gòu)：
1. 繪制結(jié)腸組織的單細胞表達譜
2. 細胞亞群鑒定，介紹有意義的新的功能細胞亞群
3. 與健康組織相比，疾病期間結(jié)腸組織的細胞亞群比例的改變以及特有細胞亞群的出現(xiàn)
4. 細胞亞群在不同疾病狀態(tài)（健康、非炎癥、炎癥）下表達譜的改變（主要是上皮、免疫細胞群的改變）
5. 分析UC患者介導抗TNF治療的細胞亞群的種類和抗藥性機制
6. 通過分析細胞間相互作用網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)隨疾病狀態(tài)改變，細胞亞群的區(qū)室化作用如何改變
7. 利用配-受體關系，建立預測模型預測細胞亞群數(shù)量關系
亮點：
①分析19名潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者和12名健康人結(jié)腸粘膜中近37萬個單細胞轉(zhuǎn)錄組，鑒定出51種細胞亞群，主要是上皮、基質(zhì)和免疫細胞；
②M樣細胞、炎性單核細胞、炎性成纖維細胞（IAF）、CD8+IL-17+T細胞，在UC中增多，是細胞間互作的核心；
③炎性單核細胞和IAF可能分別通過表達抑瘤素M（OSM）及其受體，介導抗TNF治療的耐藥性；
④許多UC風險基因具有細胞類型特異性，根據(jù)基因共表達情況，可將過半數(shù)的風險基因歸于10個模塊（基因調(diào)控通路）；
⑤基因在細胞內(nèi)的共表達允許推斷風險基因之間的潛在的因果性基因。
摘要：全基因組關聯(lián)研究（GWAS）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的風險等位基因。為了解它們的細胞類型特異性和作用途徑，我們從18個UC患者和12個健康人的結(jié)腸粘膜中獲取了366,650個細胞的圖集，揭示51種細胞，主要分上皮細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞三大類，包括BEST4?+腸上皮細胞，微折疊樣細胞和IL13RA2?+?IL11?+炎性成纖維細胞，這與抗TNF治療的抗藥性相關。共表達CD8 and IL-17的IAF、炎癥單核細胞、微折疊樣細胞和T細胞隨著疾病的發(fā)展而擴增，形成細胞間相互作用的樞紐。許多UC風險基因是細胞類型特異性的，并且受到相對較少的基因調(diào)控通路的共同調(diào)控。在這些觀察的基礎上，我們提名并推斷了GWAS基因座中特定風險基因的功能。這項工作不僅鑒定出在炎癥性腸?。↖BD）這個疾病模型中一些已知的風險基因在不同細胞類型和信號通路的分布，同時為今后利用單細胞測序技術去尋找疾病的成因以及治療方法提供了一個很好的技術框架。
關鍵詞：炎癥性腸??；潰瘍性結(jié)腸炎；炎癥；抗TNF抵抗；大腸；結(jié)腸；單細胞RNA-seq；單細胞基因組學；細胞間相互作用；全基因組關聯(lián)研究.
1. Introduction
組織通過多種上皮細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞的協(xié)同作用發(fā)揮功能。由于原發(fā)的細胞功能障礙或其他試圖重建體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細胞的代償作用，任何區(qū)室的破壞都可能導致疾病。這種相互作用關系可能使人們很難確定疾病基礎的因果機制。在結(jié)腸粘膜的特殊情況下，破壞會導致潰瘍性結(jié)腸炎（UC）發(fā)生，這是一種炎癥性腸?。↖BD）。
已知的疾病風險等位基因突出了IBD發(fā)病機理的關鍵通路，包括先天性的和適應的免疫，即腸道屏障功能以及病原體感知和反應。然而，潛在的風險位點的基因尚未被對應到其細胞亞群和作用路徑。此外，盡管內(nèi)鏡檢查后的組織病理學分析是當前的護理標準，但它未能捕獲到疾病的精細細節(jié)，例如細胞比例、特定細胞類型的表達、細胞間的相互作用，并且不能區(qū)分慢性炎癥和疾病的恢復。
單細胞RNA測序?(scRNA-seq) 通過全面繪制組織中的細胞類型和狀態(tài)，從細胞頻率的變化中解開（潰瘍性結(jié)腸炎期間的）基因程序表達的變化，并通過細胞間相互作用（細胞微環(huán)境）連接細胞頻率的變化和基因程序表達的變化，從而幫助促進我們對人類疾病的理解。在這里，我們將單細胞RNA測序應用在UC上，使用從健康人和潰瘍性結(jié)腸炎患者中收集的活檢腸道樣本生成和查詢健康和患病結(jié)腸的單細胞圖譜。
2. Results
2.1 scRNA-Seq Atlas of Colon Biopsies from Healthy Individuals and UC Patients
我們從18名治療方案各異的UC患者和12名健康人的結(jié)腸鏡檢查中獲取了68份活檢樣本（每份~2.4mm2），進而獲得了366,650個高質(zhì)量的單細胞轉(zhuǎn)錄組?(Figure?1A;?STAR Methods;?Table S1)。我們分兩個階段進行了研究：從7例UCC患者和10例健康人身上收集到的34例結(jié)腸活檢樣本及相應的115,517例單細胞譜作為訓練集(Figure?1A;?STAR Methods;?Table S1)，從另外的11例UC患者和2例健康人身上收集到的34例結(jié)腸活檢樣本及相應的251,133例單細胞譜作為測試集。
為研究健康粘膜和發(fā)炎粘膜的過渡，同時減少患者個體特異性的變異，我們收集了每名受試者的配對樣本。對于UC患者，配對樣本是指內(nèi)窺鏡下評估為鄰近正常組織的（非發(fā)炎）組織和發(fā)炎或潰瘍的組織（發(fā)炎）(Figure?1A;?STAR Methods)。為了估計這種變異，我們從12名健康受試者以及3名UC患者的非發(fā)炎和發(fā)炎區(qū)域分別獲得了兩個位置匹配的樣本（距離約為1-2 cm）。然后，我們從每個樣本中分離出“上皮”（EPI）和“固有層”（LP）成分，并進行了scRNA-seq(STAR Methods)。我們證實，炎癥相關基因集的表達在健康樣本、非發(fā)炎樣本和發(fā)炎樣本間逐漸增加(Figure?1B)。
2.2 A Comprehensive Census of 51 Cell Subsets and Their Molecular Signatures
51個細胞亞群及其分子特征的全面普查
經(jīng)過scRNA-seq，單細胞測序圖譜通過聚類將所有的細胞劃分為51個細胞亞群（圖1C，經(jīng)過技術和生物變異校正后；STAR方法），并用已知的Markers進行了標注（圖1D）。我們聚類的細胞亞群的結(jié)果是魯棒的且具有可重復性的，這是因為幾乎所有的細胞亞群都由全部的樣本所代表（圖1E），并且各種細胞亞群的細胞數(shù)按比例分布在患者個體之間(Figures S1A and S1B)。發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列是高度一致的（圖S1B-S1D），從相同疾病狀態(tài)下的相同甚至不同個體收集的重復數(shù)據(jù)也是如此(圖S1E；STAR方法)。
這51個子集包括15個上皮細胞亞群，沿著從腸道干細胞（ISC）到成熟細胞命運的分化軌跡排序（Haber等人，2017年?;?圖1?F;?STAR方法）。除此之外，還包括8個成纖維細胞，4個內(nèi)皮細胞，1個神經(jīng)膠質(zhì)細胞，7個髓樣細胞，4個B細胞，10個T細胞（CD4?+傳統(tǒng)T輔助細胞[Tconv?]，調(diào)節(jié)性T [T?reg?]，CD8?+和γδ） ，1個先天淋巴樣細胞（ILC）和1個自然殺傷（NK）細胞亞群（圖1?C）。缺少的細胞類型包括粘膜下腸神經(jīng)元，需要通過單核RNA-seq進行分離（Habib等人，2016），漿細胞樣樹突狀細胞（DC）和中性粒細胞（Schelker等，2017）。每個亞群都有已知和新穎的markers（圖1?D；表S2）支持，包括轉(zhuǎn)錄因子（TF），G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）和細胞因子（圖S2?A–S2C；表S3）。在大多數(shù)樣本的單細胞測序聚類下，試圖在已有的51種細胞亞群下進一步聚類為更少的群組的嘗試不會成功。例外情況包括，免疫球蛋白A(IgA)和IgG漿細胞，以及共表達TN FRS F4/OX40和RSF18/GITR的Treg細胞，Treg細胞的共表達可能反映活化的Treg細胞與靜止的Treg細胞。
2.3 Characterization of?BEST4+?Epithelial Cells and?RSPO3+?Fibroblasts in the Healthy Colon
健康結(jié)腸中BEST4 +上皮細胞和RSPO3 +成纖維細胞的表征
我們的全面調(diào)查顯示，表達BEST4的腸上皮細胞不同于其他上皮細胞（Parikh等，2019），富含與pH感應和電解質(zhì)平衡有關的基因（原位驗證;圖1?G，1H和S1D）。基因包括了Otopetrins?2和Otopetrins3?(OTOP2/3)，這些質(zhì)子通道可檢測pH值并構(gòu)成酸味感知的基礎（Tu等人，2018年）;?碳酸酐酶VII（CA7），可催化碳酸氫鹽的形成；和Bestrophin-4（BEST4），它們可能排出碳酸氫鹽（Qu和Hartzell，2008）。BEST4?+腸上皮細胞約占兩名克羅恩病（CD）患者回腸上皮的1％（11,473個細胞；數(shù)據(jù)未顯示）。
多個成纖維細胞亞群因WNT/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號基因的表達而不同，可能反映了沿隱窩-絨毛軸的不同位置（Powell等人，2011?;?Shoshkes-Carmel等人，2018）。一些富含WNT2B，WNT4和DKK3，表明它們位于隱窩附近，而另一些富含BMP4，BMP5和WNT5A / B并可能靠近絨毛（圖1?I）。據(jù)報道，這些基因中有許多是上皮下上皮細胞的標志物，上皮下的上皮細胞是支持上皮的罕見成纖維細胞群體（Shoshkes-Carmel等人，2018）;?但是，在我們的數(shù)據(jù)中，這些基因表達產(chǎn)物廣泛分布在所有細胞亞群中（例如FOXL1，DKK3和WNT5B；圖1?I）。
表達WNT2B?+的成纖維細胞的一個亞群可能通過與ISC受體LGR5相互作用的R-spondin-3（原位驗證，圖1?G-1I）表達來支持ISC生態(tài)位（de Lau等，2011）。RSPO3?+成纖維細胞表達其他WNT / BMP信號基因和幾種不同的趨化因子（圖1?G和1I），這些因子可能將免疫細胞募集到ISC生態(tài)位（Biton等人，2018年）。它們還富含預測結(jié)直腸癌（CRC）預后不良的基因（Calon等人，2015年），并可能通過促進干細胞樣微環(huán)境來支持腫瘤生長（圖S5A）。
2.4 Remodeling of the Colon’s Cellular Composition?during Disease
疾病期間結(jié)腸細胞組成的重塑
通過使用考慮成分依賴關系的多變量測試（圖2?A）和單變量測試（圖S3?A和S3B；STAR方法），發(fā)現(xiàn)在非發(fā)炎或發(fā)炎樣本中，許多細胞亞群的比例與健康對照組相比差異顯著。例如肥大細胞（King等，1992），CD8?+?IL-17?+?T細胞（Tom等，2016）和Treg細胞（Holmén等人，2006。?;?圖2?A，S3?A，和S3B）比例的增加。
微褶（M）細胞通常與人小腸的淋巴樣組織相關，在這里，它們對于識別腸道菌群很重要（Mabbott等，2013）。在結(jié)腸中，在健康個體中很少發(fā)現(xiàn)M樣細胞，但在炎癥過程中擴增了17倍（原位驗證；圖S3?A和S3D）。它們高度表達幾種趨化因子（例如，CCL20和CCL23；圖1?G），表明參與了將免疫細胞募集到炎癥部位的進程。
粘液層缺陷（Xavier和Podolsky，2007年）無法通過表達的變化來解釋，表明它們可能在轉(zhuǎn)錄后出現(xiàn)。盡管杯狀細胞的頻率沒有變化，但杯狀細胞祖細胞在炎癥過程中減少了，既是離散的細胞亞群（圖2?A），又是分化的連續(xù)體（圖1?F和2?D；STAR方法）。
盡管免疫細胞的總數(shù)隨疾病而增加（Danese和Fiocchi，2011年），但在B細胞譜系內(nèi)，從漿細胞向濾泡（FO）細胞轉(zhuǎn)移（原位驗證；圖2?A和2B）。在漿細胞中，相對于IgG+細胞，IgA?+細胞頻率降低（圖S3?C），這表明炎癥與免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換有關（Scott等，1986）。
2.5 An Inflammation-Associated Fibroblast Subset Is Unique to the UC Colon
炎癥相關的成纖維細胞IAF亞群是UC結(jié)腸所特有的
雖然大多數(shù)成纖維細胞亞群均存在于健康個體和UC患者中，一種被稱為炎癥相關成纖維細胞（IAFS）的亞群的細胞數(shù)在部分患者發(fā)炎組織中擴增了189倍（>固有層細胞數(shù)的1%,原位驗證, 圖2A和圖2C）。IAFs在許多與結(jié)腸炎、纖維化和癌癥相關的基因上活躍表達，包括?IL11,?IL24, and?IL13RA2?(Figure?1G). 白細胞介素-11 (IL-11)是小鼠和潛在的人類纖維化的調(diào)節(jié)劑（Schafer等人，2017）。IAFs包括了WNT2B+?and?WNT5B+亞群(圖S3E)，表明它們可能沿隱窩-絨毛軸反映了不同的狀態(tài)。
IAF表達與癌癥相關的成纖維細胞（CAF）的標志物，包括FAP，TWIST1和WNT2。 IAF標記物的表達水平與414個二代測序的RNA-seq 大腸癌樣本之間的相關性高于對照(Cancer Genome Atlas, 2012;?Figure?S5B; Spearman’s ρ?=?0.67)，這表明IAFs在腫瘤中的擴展Figure?S5B。
二、炎癥與非炎癥組織的表達譜變化
2.6 Most Expression Changes during Disease Are Shared by Non-Inflamed and Inflamed Tissue
疾病過程中大多數(shù)表達變化是由非炎癥和炎癥組織共同分擔的
為了確定與疾病相關的表達變化，我們將表達建模為反映1細胞亞群，2疾病狀態(tài)（健康，非發(fā)炎或發(fā)炎）和，3校正環(huán)境RNA污染的技術協(xié)變量的總和。我們區(qū)分了上皮，先天或適應性區(qū)室中跨細胞亞群共享的變化?(Figures 3A–3C and?S4A–S4C,?Table S4) 與每個亞群所獨有的變化(Figures 3D–3F and?S4D–S4F;?Table S4;?STAR Methods)。
內(nèi)窺鏡評估下的未發(fā)炎和發(fā)炎的組織具有相似的差異表達（DE）基因特征(Figure?3G;?Table S4)，表明UC的轉(zhuǎn)錄特征在發(fā)炎之前或在消退后持續(xù)存在。在整個上皮細胞中，DE基因反映了通過激活先天免疫力來恢復體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的嘗試（例如抗微生物和抗氧化防御途徑，粘蛋白生物合成以及主要組織相容性復合物（MHC）II類機制）(validatedin situ;?Figures 3A, 3D, and 3H;?Biton et?al., 2018,?McDonald and Jewell, 1987)。在基質(zhì)內(nèi)，成纖維細胞誘導炎癥，纖維化和組織修復的基因，而內(nèi)皮細胞的變化支持組織血管形成(Figures 3B and 3E).。在免疫細胞中，髓樣和T細胞激活了共刺激和共抑制基因，而B細胞上調(diào)了IgG類轉(zhuǎn)換（上文中，相對于IgG+細胞，IgA?+細胞頻率降低）和親和力成熟的基因(Figures 3C and 3F)。
2.7 Concerted?Metabolic?Shifts in Epithelial Cells during Inflammation
炎癥過程中上皮細胞的協(xié)同代謝變化
比較未發(fā)炎和發(fā)炎的UC組織(Figures S4A–S4F;?Table S4)，可以發(fā)現(xiàn)伴隨著發(fā)炎而來的一些上皮細胞的代謝改變。例如，嘌呤代謝的改變（例如XDH和URAD）可能會產(chǎn)生尿酸，與上皮損害相關?(Chiaro et?al., 2017)。上皮細胞誘導犬尿氨酸途徑?(Figure?4A)，與疾病嚴重程度有關(Sofia et?al., 2018)。犬尿酸受體GPR35是一個推定的風險基因(Huang et?al., 2017)。
在炎癥過程中對239個KEGG通路的變化作圖(Figures 4B and?S5C;?STAR Methods)揭示了腸上皮細胞的其他代謝變化，包括從氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變，精氨酸生物合成酶的誘導（例如，NOS2和ASS1），以及用于降解支鏈氨基酸的酶的下調(diào)，尤其是AUH（一種推定的風險基因）（Liu等，2015）。腸上皮細胞還誘導了HIF1途徑，這是單核細胞糖酵解轉(zhuǎn)變的一個原因（Kelly和O'Neill，2015年）。這些變化可能是由于腸道細菌短鏈脂肪酸生產(chǎn)受損所致（den Besten et al.，2013），因為上皮細胞下調(diào)了β-氧化途徑以及丁酸和丙酸的代謝途徑，但上調(diào)了膳食脂肪酸的途徑（例如，α-亞油酸）。
2.8 Induction of a Pro-Inflammatory IL-17 Response and Immune Checkpoints?in T Cell Subsets
T細胞亞群中誘導促炎性IL-17反應和免疫檢查點
在T細胞中，幾個CD4?+亞群上調(diào)了IL17A（圖4?C），可能反映了IL17A表達的每細胞增長以及Th17細胞的擴增。出乎意料的是，在兩種疾病狀態(tài)下（炎癥和非炎癥），CD8?+亞群對IL17A的誘導最強（圖4?C-4E）。原位分析揭示這兩個CD4?-和CD4?+細胞共表達CD8和IL17A（圖4?d和4E）。盡管CD8?+?IL-17?+T細胞已經(jīng)被報道了（Cortez等人，2014，Srenathan等人，2016），CD4+?CD8?+?IL-17?+?T細胞在很大程度上未表征。這些細胞還激活了小鼠Th17致病性相關的細胞毒性程序和基因（例如RBPJ和IL23R；圖3?F和4?C；Gaublomme等人，2015），這可能會加劇組織損傷。T細胞的大多數(shù)亞群誘導了共刺激和共抑制程序（圖4?C），與抑制免疫激活的嘗試一致（Attanasio和Wherry，2016）。
三、耐藥性
2.9 TNF?Expression Shifts to Treg, FO B, and?CD8+IL-17+?T?Cells during Inflammation
炎癥期間TNF表達轉(zhuǎn)移至T?reg，F(xiàn)O B和CD8?+?IL-17?+?T細胞（耐藥性）
單克隆抗TNF抗體是IBD的突破性療法，但是30％的IBD患者無反應，并且許多人獲得了耐藥性（Rutgeerts等，2004）。腫瘤壞死因子（TNF）的表達在UC期間發(fā)生了變化，Treg細胞成為TNF表達的關鍵角色。在CD8?+?LP和活化的CD4?+?Fos?hi?T細胞中，每細胞TNF的基線表達最高，但在發(fā)炎的組織中，TNF在Treg和FO B細胞中被誘導（原位驗證；圖5?B和S5?D）。當估算由每個細胞亞群表達的TNF總量時（圖5?A）T?reg細胞，在健康組織中占TNF表達的1％，但在炎癥過程中占14％以上（僅次于活化的CD4?+?T細胞）。
2.10 IAFs and Inflammatory Monocytes Are Associated with Resistance?to Anti-TNF Therapy
IAF和炎性單核細胞與抗TNF治療的耐藥性相關
IAF中表達最活躍的基因之一是推定的風險基因OSMR（Liu等人，2015），以及預測抗TNF反應的細胞因子抑瘤素?M（OSM）的受體（West等人，2017）。OSM和OSMR過去被認為分別由未知的髓樣和基質(zhì)細胞表達（West等，2017）。OSM最富于炎性單核細胞和DC2，而OSMR最富于IAF（原位驗證；圖5C）。伴隨著炎癥過程中這些亞群的擴增，上述發(fā)現(xiàn)使我們假設結(jié)腸的細胞重塑可能部分解釋了OSM與耐藥性之間的關系。
因此，基于對60位有反應者和57位無反應者對治療的bulk表達數(shù)據(jù)的薈萃分析（Wang等人，2016年?;?STAR方法），我們對各個細胞亞群的抗TNF的耐藥性和敏感性的基因信號進行了評分。藥物抗性信號在IAF、炎性單核細胞和DC2細胞中大量富集（圖5?D和5E），而在上皮細胞中則具有藥物敏感性信號（圖5?D）。與耐藥性最相關的三個基因IL13RA2，TNFRSF11B和IL11是?IAF的marker，在其他細胞中很少表達（圖5E）。一項逆向分析使用IAF基因信號，推斷了來自20個藥物反應者和27個非反應者的治療前的IAF的整體(bulk)表達數(shù)據(jù)水平（圖5?F;?STAR方法），證實了IAFs豐富的患者會對抗TNF治療產(chǎn)生抵抗。因此，IAF可能與West等（2017）報道的OSM介導的抗性有關。
潛在的耐藥機制是OSM與TNF協(xié)同作用（West等，2017）或表型復制。為了檢驗這些假設，我們研究了跨細胞亞群的TNF與OSM信號之間的關系。簽名在細胞亞群之間緊密相關（即使在刪除共享基因后也是如此），并且兩者均與耐藥性簽名相關（圖5?G）。這表明OSM表型為TNF，激活了IAF中的下游靶標。因此，IAF和炎性單核細胞可能會在TNF阻滯期間補償，從而導致耐藥性。
2.11 Rewiring of Cell-Cell Interactions via Inflammation-Associated Cell Subsets during Disease
疾病期間基于炎癥相關細胞亞群的細胞間相互作用的重構(gòu)
為了更普遍地描述結(jié)腸炎期間細胞與細胞相互作用的重塑，我們將受體-配體對（Ramilowski等，2015）映射到細胞亞群上，以構(gòu)建跨疾病狀態(tài)的假定的細胞-細胞相互作用網(wǎng)絡（圖6?A-6C），識別出細胞亞群對對具有比空模型明顯更多的受體-配體連接（STAR方法）。
健康的相互作用描繪了不同的細胞區(qū)室（圖6?A），而疾病期間的DE基因靶向譜系間的串擾和減少的區(qū)室化（圖6?B和6C），其中UC相關的細胞亞群充當關鍵網(wǎng)絡中心（圖6?D）。在健康的粘膜中，相互作用在很大程度上反映了腸道穩(wěn)態(tài)（例如，DC1細胞和T細胞；圖6?A； p <0.05）。相反，上皮細胞與成纖維細胞和T細胞之間的非炎癥相互作用更為豐富（圖6?B；所有p <10?-4），而炎癥組織顯示B細胞、T細胞、巨噬細胞和CD8?+?IL-17?+T細胞之間相互作用的重新連接（圖6?C；所有p <10?-4）。UC相關亞群（例如M樣細胞，IAF和炎性單核細胞）是網(wǎng)絡中最中心的節(jié)點（圖6?D），表明它們在不同細胞亞群之間介導信號。
2.12 Cell-Cell Interactions Predict the Infiltration, Proliferation, and Differentiation of Cell Subsets during Inflammation
細胞間相互作用預測炎癥過程中細胞亞群的浸潤，增殖和分化
我們假設細胞亞群比例的變化可以用其他細胞表達的細胞-細胞相互作用基因的變化來解釋。為了測試這一點，我們查詢了所有細胞亞群對，對于每個受體-配體對，檢查樣品中一個細胞亞群中配體的表達水平是否與樣品中表達其受體的細胞亞群的比例（包括自分泌相互作用）相關。該分析發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種重要的相互作用（圖6?E；表S5；STAR方法）。
例如，炎癥過程中腸上皮細胞對IL18的上調(diào)與表達其受體IL18R1的T?reg細胞比例增加相關（圖6?E； Spearman’s ρ= 0.68）。在小鼠中，IL-18既抑制Th17分化，又允許T?reg細胞介導的腸道炎癥控制（Harrison等，2015）。但是，上皮細胞在將Treg細胞募集到結(jié)腸中的作用尚不清楚。表達IL22RA1的腸上皮細胞的頻率與調(diào)節(jié)腸再生的IL22的CD4 +激活的Foshi T細胞的表達相關（Pelczar等人，2016?;?圖6?E; Spearman的p = 0.55）。我們在人類結(jié)腸球體培養(yǎng)中驗證了這種相互作用，其中與IL-22的孵育誘導了表達程序，該表達程序與ISC相比在腸細胞中顯著豐富（圖S6?A； p <10?-10；Wilcoxon測試）。
其他因素會促進免疫細胞的募集（例如CXCL12促進B細胞）和基質(zhì)細胞的擴增（例如PDGFD對于周皮細胞；OSM對于IAF），或者是可能調(diào)節(jié)細胞存活，增殖或死亡的自分泌信號（例如MST1對BEST4?+腸上皮細胞；TNFSF10對毛細血管后小靜脈）（圖6?E）。最后，我們開發(fā)了最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸模型，以識別跨越多種細胞亞群的數(shù)目關系（圖6?F，6G，S6?B和S6C；STAR方法）。例如，CD8?+?IL-17+?T細胞的比例由上皮細胞，T細胞，成纖維細胞和神經(jīng)膠質(zhì)的自分泌和旁分泌相互作用共同解釋（圖6?F）。
2.13 Many IBD Risk Genes Are Cell Type or Lineage Specific and Differentially Expressed in Disease
許多IBD風險基因是細胞類型或譜系特異性的，并且在疾病中差異表達
為了使用scRNA-seq詢問IBD遺傳學，我們研究了跨越346個候選風險基因的151個IBD和UC風險位點（STAR方法）。對于大多數(shù)基因座，關聯(lián)信號背后的基因是未知的。但是，在某些情況下，可能暗示單個基因，因為它包含精細映射或非同義的編碼變體，或被解析為沒有其他基因的連鎖不平衡區(qū)域。使用這種方法，我們編制了一組57個與GWAS相關的風險基因，這些基因很可能與IBD因果相關（表S6；STAR方法）。
將這57個與GWAS相關的風險基因定位到我們的圖集上， 揭示了在疾病期間，29個風險基因富集在特定譜系(圖7A)，36個風險基因顯著DE（圖?S7A和S7B）。除了已知的關聯(lián)（例如，NKX2-3在微血管細胞富集表達和HNF4A在腸上皮細胞富集表達）（Stegmann et?al., 2006,?Wang et?al., 2000），我們發(fā)現(xiàn)了幾個新的關系（表S6）。例如，intelectin 1（ITLN1），一種脂筏蛋白，定位于上皮刷狀緣（Wrackmeyer等，2006），在不成熟的杯狀細胞中富集。一些細胞亞群被富集用于表達幾個GWAS相關的風險基因（圖7?B）。值得注意的是，M樣細胞以比其他細胞更高的水平表達許多風險基因（例如，NR5A2，CCL20和JAK2；圖7A；表S6），表明M樣細胞功能障礙可能在疾病中起重要作用。
2.14 Co-variation of Gene Expression within a Cell Type?Helps Predict Functions for IBD Risk Genes
同一細胞類型內(nèi)基因表達的共改變有助于預測IBD風險基因的功能
我們假設相同亞組的單個細胞之間基因表達的變化可以使我們推斷IBD風險基因的功能。過去的方法通常在整個組織樣本中使用“guilt by association”，但無法區(qū)分表達的變化和細胞比例的變化。相比之下，我們測量了細胞亞群內(nèi)單個細胞之間基因的共變，從而使我們能夠分離出這些細胞中的共同調(diào)控過程（Tanay和Regev，2017年?;?STAR方法）。
通過這種方式，我們?yōu)樗斜磉_的細胞亞群中的57個GWAS涉及的IBD風險基因構(gòu)建了基因模塊，并用推定功能對其進行了注釋（表S6；STAR方法）。例如，在健康的上皮細胞內(nèi)，C1orf106模塊富含緊密連接和粘附連接基因（分別為q??<10?-6和10-2；Fisher精確檢驗）。我們最近表明C1orf106參與細胞-細胞連接（Mohanan等人，2018）。
2.15 Multiple IBD Risk Genes Co-localize in Shared Gene?Modules, Revealing Key Pathways in IBD
多個IBD風險基因共定位于共享基因模塊中，揭示了IBD中的關鍵途徑
在許多情況下，多個推定的IBD風險基因是同一基因模塊的成員，這使我們能夠定義10個“元模塊”，跨越GWAS涉及的IBD風險基因的50％以上，這可能反映了關鍵的疾病途徑（經(jīng)驗q??<0.05 ；圖7?C；表S7；STAR方法）。例如，健康巨噬細胞中的PRKCB元模塊包含5個其他風險基因（GPR65，ADCY7，PTGER4，PTPRC和SH2B3），并可通過循環(huán)AMP（cAMP）信號調(diào)節(jié)巨噬細胞的激活。另外，JAK2UC相關M樣細胞中的元模塊包含4個其他風險基因（CCL20，PTGER4，SH2B3和AHR），并可能調(diào)節(jié)M樣細胞中的TNF信號傳導。
2.16 Single-Cell Expression and Co-expression Help Nominate?Causal Genes across GWAS Loci
單細胞表達和共表達有助于在GWAS基因座上提名因果基因
IBD風險基因的功能一致性表明，單細胞表達或共表達可以幫助查明與多個候選基因在基因座處締合信號基礎的基因。為此，我們確定了20個IBD和UC風險區(qū)域（每個區(qū)域都跨越一個以上的基因），其候選基因集包含GWAS牽連的風險基因，我們將其稱為該區(qū)域的“正確”基因（STAR方法）。然后，對于每個這樣的區(qū)域，我們測試（1）表達，（2）差異表達或（3）與其他候選基因（在基因座上迭代定義；STAR方法）共表達的程度是否可以恢復“正確”的風險相對于其中隨機選擇基因的無效模型的區(qū)域基因（STAR Methods）。無效模型具有33％的準確性，當我們選擇在任何一種疾病狀態(tài)下具有最大DE系數(shù)的基因時，準確性都不會提高（圖7?D）。但是，當我們選擇在任何細胞亞群中表達最高的基因（圖7?D；準確度55％，經(jīng)驗值p = 0.03）或?qū)儆谄渌蜻x基因的最大模塊（圖7?D； 63％）時，我們的預測會大大改善。準確度，經(jīng)驗值p = 0.001）。對于CD基因座，沒有任何方法能明顯優(yōu)于無效模型（圖7?D），這表明UC和CD的獨特風險基因在不同位置或僅在患病組織中有活性。
最后，我們使用這種共表達方法在所有IBD / UC風險基因座中提名了因果基因，其中包括56個驅(qū)動該關聯(lián)的基因未知的基因（圖7?E；表S7）。我們回收了許多已知的IBD和UC危險因素（例如HNF4A，IFIH1和GPR35），但未能識別其他危險因素（例如RNF186；圖7?E），突出了我們方法的局限性（討論）。此外，該分析對53個不在GWAS涉及的基因中的基因產(chǎn)生了預測，包括RORC，ITGAV和SMURF1（圖7?E）。
Discussion
通過在臨床環(huán)境中利用scRNA-seq，我們評估了腸道活檢中特定細胞亞群中的細胞組成，基因表達，細胞間相互作用以及IBD風險基因途徑。盡管區(qū)分成因和挑戰(zhàn)具有挑戰(zhàn)性，但將單細胞數(shù)據(jù)與臨床反應（例如IAF），細胞-細胞相互作用（例如腸上皮細胞和T細胞）或風險基因表達（例如M樣細胞）相關可以幫助告知疾病的病因?qū)W，并突出了治療干預的新機會。
M樣細胞在基線時很少被檢測到，但在炎癥過程中會擴展并在細胞-細胞相互作用網(wǎng)絡中充當樞紐（圖6D; S3A和S3D）。 這種擴張可能反映了第三級淋巴組織或前哨細胞（Mabbott等，2013）。 ?M樣細胞具有GWAS風險基因的最高表達（圖7A和7B），包括CCL20，其表達與樣品中Treg細胞的頻率相關（表S6）。他們具有最大的預測風險基因模塊（表S7），富含內(nèi)吞作用和Th17分化基因（q <10-3，F(xiàn)isher精確檢驗），這可能反映了抗原的轉(zhuǎn)胞吞作用和傳遞。
CD8 + IL-17 + T細胞和Treg從健康組織擴張到非發(fā)炎組織（圖2A），并在炎癥過程中分別成為IL-17（圖4C）和TNF（圖5A，B）的主要來源。前者可能有助于T細胞的致病性和組織損傷（圖4D和4E; 66％共表達CD4）。 盡管后者可能采取了類似效應子的狀態(tài)，但與TNF-Treg細胞相比，它們對Treg細胞標志物（例如FOXP3，CTLA4和IL10）的富集程度更高（數(shù)據(jù)未顯示）。未來的工作將確定TNF + Treg細胞是否有助于疾病病理或抗TNF抵抗（Atreya et al。，2011），以及CD8 + T細胞可塑性在腸道炎癥中的作用。
OSM信號傳導通過未知的髓樣和基質(zhì)細胞類型參與抗TNF抵抗（West et al。，2017）。 在這里我們顯示出炎性單核細胞和IAFs可能分別通過OSM和OSMR的表達介導耐藥性（圖5D）。 尤其是，IAF富含抗TNF無反應者的預處理樣品（圖5F）。 此外，我們確定OSM表型為TNF，這可以解釋抗TNF的耐藥性。 未來的工作將確定IAF是否是藥物反應的有力生物標志物，或者將抗TNF藥物與抑制IAF細胞因子和/或受體結(jié)合可以降低UC患者的抗TNF耐藥性。
IAFs獨特表達IL11，這是纖維化的潛在治療靶點（Schafer et al。，2017），表明參與了腸纖維化。 因為它們表達了隱窩相關（WNT2B +）和絨毛相關（WNT5B +）標記（圖1I和S3E），所以IAF可能反映了不同的成纖維細胞狀態(tài)。 ?IAFs表達了幾種CAF標記，并且IAF標記在CRC腫瘤中富集（圖5S5B），表明有共同的起源和/或狀態(tài)。 癌癥相關炎癥期間IAF的擴張可能會影響腫瘤的微環(huán)境。 最后，IAF和炎性單核細胞均在細胞-細胞相互作用網(wǎng)絡中形成集線器，并可能影響其他細胞的比例（圖6E;表S5）。
通過利用單細胞共表達，我們將超過50％的風險基因定位到10個元模塊上（圖7C），并使用這些元模塊在各個基因座上提名因果風險基因（圖7E）。但是，這種方法可能無法識別低表達，在未分析或未與其他風險基因共表達的細胞和/或組織中活躍的風險基因。 當多個風險基因作用于同一基因座時，它也可能失敗。 但是，我們發(fā)現(xiàn)即使在對基因進行評分時，無論區(qū)域如何（而不是每個區(qū)域選擇一個基因），它都能改善預測結(jié)果（圖S7D; STAR方法）。 我們希望這些分析將為人類遺傳學和單細胞基因組學的結(jié)合鋪平道路，以便通過將風險基因模塊與多基因風險評分相關聯(lián)，將變體映射到單細胞表型以及將非編碼變體映射到細胞來更好地了解多基因疾病。 單細胞等位基因特異性表達和表達定量性狀基因座（eQTL）分析。
我們的工作為使用scRNA-seq了解人類疾病及其治療反應提供了框架。 我們確定與疾病狀態(tài)有關的細胞比例和基因表達的變化，并將其整合以了解細胞信號傳導和藥物敏感性的機制。 最后，我們在各個基因座上提名風險基因，預測它們的作用細胞和推定功能，并將它們組裝到構(gòu)成疾病基礎的核心途徑中。
