MRD（Minimal Residual Disease），即微小殘留病灶，指癌癥患者在治療中或治療后體內(nèi)仍有殘留的惡性腫瘤細胞存在，細胞壞死或凋亡過程中釋放出腫瘤循環(huán)DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。同時也有NCCN指南和專家共識將MRD表示為Measurable Residual Disease，即可測量殘留病灶[1]。MRD會引起癌癥患者術后腫瘤復發(fā)，所以癌癥患者需要監(jiān)控MRD，監(jiān)測術后腫瘤復發(fā)風險。
基于檢測ctDNA的技術因其高靈敏度和無創(chuàng)、便捷等特點，優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床或影像學方法鑒定出有腫瘤復發(fā)的患者。但是ctDNA的檢測受大量游離DNA（cell-freeDNA，cfDNA）背景信號影響。因此，MRD檢測應使用高靈敏度的檢測技術。目前檢測MRD的技術眾多（詳見圖2），而最廣泛使用的檢測技術是其中三種：?
1）多參數(shù)流式細胞術（MFC），是一種快速、定量鑒定癌細胞的方法，其峰值靈敏度為0.01%，即1萬個正常細胞中的1個癌細胞。6色（或更多）流式細胞術分析是檢測異常MRD免疫表型的最常用方法。
2）聚合酶鏈式反應技術，分為qPCR或RT-qPCR，可以根據(jù)其特有的遺傳變異，如突變或染色體變異識別惡性腫瘤細胞；本質(zhì)上是癌細胞的特定DNA片段被復制和擴增，使它們更容易檢測和計數(shù)，因此即使癌細胞數(shù)量非常少，也能通過PCR檢測出基因異常；
3）NGS是一種極為敏感的DNA測序方法，其峰值靈敏度為0.0001%，即100萬個正常細胞中有1個癌細胞。NGS可以檢測B/T細胞抗原受體基因的克隆性重排，作為新興的MRD檢測方法，已受到國內(nèi)外專家認可并推薦。2017年版國際臨床實踐指南（NCCN）、和2017年版《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》均推薦NGS作為MRD檢測方法。
總的來說，臨床應用中，應根據(jù)不同治療目的，選擇合適的MRD檢測方法。qPCR及RT-qPCR檢測MRD的靈敏度較MFC高，但更為費時。NGS作為MRD檢測的最新技術，進一步提高了MRD檢測的靈敏度，對于評價治療療效、預測疾病復發(fā)、實施精準治療具有重要的指導意義。
個體化定制方案
MRD檢測最成熟也是最主要的應用是血液腫瘤，已成為NCCN臨床標準實踐的一部分，F(xiàn)DA唯一批準的MRD檢測產(chǎn)品也僅用于血液疾病。但隨著很多臨床試驗的推進，MRD近年也在慢慢擴展到實體腫瘤中，如乳腺癌，肺癌，結(jié)直腸癌，前列腺癌等，并以實驗室自建方法（LDT）的方式參與臨床決策【3-6】。目前實體腫瘤MRD的檢測難度較大，主要體現(xiàn)在兩方面：
1、不同實體瘤個體化差異大，即每個患者個體中僅攜帶非常少量、相同的基因突變，對panel的設計要求高。
2、早期實體瘤釋放到外周血的ctDNA含量非常少（低于1%），對檢測靈敏度要求極高。
針對上述難題有兩種解決方案：①使用NGS大panel；②開發(fā)個性化的MRD檢測panel。也就是目前采用ctDNA檢測MRD主要存在兩大技術路線：tumor-agnostic（僅基于血漿檢測的固定panel）和tumor-informed（基于腫瘤組織測序的ctDNA個性化定制方案)[7]。
由于組織先驗（tumor-informed）策略在檢測靈敏度上的優(yōu)勢，目前許多腫瘤檢測公司基于此進行開發(fā)。其技術路線為先檢測與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關基因的變異信息，形成每個患者的個性化基因變異圖譜，將其納入MRD檢測；最后通過液體活檢定向追蹤患者血液中的個性化變異。
如上圖所示，通過采集患者腫瘤組織進行全外顯子測序（WES），針對每位患者選取腫瘤特異性的克隆位點進行個性化定制NGS Panel（或使用多重PCR方法)，在監(jiān)測時提取血漿中的ctDNA進行超高深度測序，通常在術后約四周進行MRD檢測。 在一項研究中，相對于固定panel測序策略，可為病人多爭取42%的時間采取適合的對策[6]
與此同時，也有研究引入新的方法學進一步升級MRD檢測。鑒于甲基化在腫瘤發(fā)生早期已有顯著變異、變異位點數(shù)目豐富，這些表觀基因組“標記”在不同患者之間甚至在不同癌癥之間更相似，使其成為新MRD檢測方法的可能（尤其是針對早期患者）。針對甲基化位點進行設計個性化Panel，這種多組學捕獲可以對腫瘤治療全過程進行精準、高效地全程監(jiān)測。
伯科技術優(yōu)勢
1、Panel卓越的性能表現(xiàn)
不論是10Kb小Panel還是42Mb WES，伯科液相捕獲芯片均展現(xiàn)出卓越的性能：優(yōu)異捕獲效率與均一性。因此能保證個性化的panel檢測靈敏度，為MRD檢測提供優(yōu)質(zhì)的工具。
2、豐富的引物/探針設計經(jīng)驗，極速定制周期
快速針對患者選取腫瘤特異性的克隆位點設計引物/NGS Panel，最大程度實現(xiàn)MRD檢測高特異性的同時，七天極速定制周期能極大滿足臨床術后約四周進行MRD檢測的需求。
3、不管定制個性化Panel還是Spike in，極大用戶客戶需求
TRACERx研究發(fā)現(xiàn)大約12%的患者復發(fā)時是一個新原發(fā)腫瘤【9】。部分檢測機構(gòu)為了提高MRD檢測靈敏度的同時降低檢測成本，采用基礎模塊（癌癥中常見的熱點驅(qū)動基因突變位點）+個體化模塊（個體化突變位點）組合個體化定制panel代替原有大panel進行MRD檢測。不論是小區(qū)域還是大區(qū)間，不論是Spike-in到小Panel還是全外顯子，伯科探針體系均能勝任，實現(xiàn)了MRD檢測廣度和深度上的完美結(jié)合。
4、擁有多組學共捕獲Panel開發(fā)經(jīng)驗
例如DNA&RNA共捕獲技術。隨著檢測技術的進步，可進一步支撐DNA&Methyl共捕獲等技術流程的開發(fā)。
參考文獻
[1] Minimal Residual Disease (MRD). (n.d.). Minimal Residual Disease (MRD). Leukemia & Lymphoma Society.
[2] Chen Xueyan, Wood Brent L., Monitoring Minimal Residual Disease in Acute Leukemia: Technical Challenges and Interpretive Complexities, Blood Reviews (2016), doi:10.1016/j.blre.2016.09.006
[3] Coakley Maria, Garcia-Murillas Isaac, Turner Nicholas C, Molecular Residual Disease and Adjuvant Trial Design in Solid Tumors. [J] .Clin Cancer Res, 2019, 25: 6026-6034.
[4] NCCN Guidelines https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/default.aspx
[5] Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution [published correction appears in Nature. 2017 Dec 20]. Nature. 2017;545(7655):446-451. doi:10.1038/nature22364
[6] Coombes RC, Page K, Salari R, et al. Personalized Detection of Circulating Tumor DNA Antedates Breast Cancer Metastatic Recurrence. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4255-4263. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-3663
[7] Prof.Jeanne Tie, 2020.ASCO-GI
[8] Shannon chuai，ctDNA Methylation & Mutation — A Two-Dimensional MRD Method Identifies More At-risk Patients and Predicts DFS in NSCLC.
[9] Zviran, A. et al. Genome-wide cell-free DNA mutational integration enables ultra-sensitive cancer monitoring. Nat Med 26, 1114–1124 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0915-3
