一個(gè)做了10年基礎(chǔ)研究菜鳥(niǎo)的一點(diǎn)兒心得，希望對(duì)喜愛(ài)科研又受困于不能做出漂亮結(jié)果的菜鳥(niǎo)們有用。

首先，希望我直接給出試劑配制加多少毫升/微克組分，電泳、轉(zhuǎn)膜多大電流電壓跑多久的同學(xué)請(qǐng)繞道，因?yàn)槲遗懿煌牡鞍锥紩?huì)調(diào)試相應(yīng)條件，這是想做好Western的前提--不能死記硬背，墨守陳規(guī)！

下面是干貨：

1、蛋白樣準(zhǔn)備。

細(xì)胞組織裂解有條件一定要加蛋白酶和磷酸酶抑制劑以及PMSF，保證蛋白的完整。β巰基乙醇一定要加，尤其是有很多亞基的蛋白，只有把亞基間的二硫鍵破壞，才能得到你的抗體所檢測(cè)的蛋白多肽。

有條件一定要測(cè)定蛋白濃度，不要迷信于基于細(xì)胞計(jì)數(shù)+調(diào)內(nèi)參的Western，事實(shí)是在特定處理下，內(nèi)參的表達(dá)也會(huì)發(fā)生改變（例如PDGF-bb處理就會(huì)改變actin）。在這種情況下，只有用蛋白濃度計(jì)算得到的上樣量才是標(biāo)準(zhǔn)上樣量，才能進(jìn)行橫向比較。

測(cè)完濃度，計(jì)算得到相同上樣量所需體積后，一定要保證最后的跑膠樣品上樣體積和樣品中的離子濃度一樣（這是你跑出相同寬度完美條帶的必要條件）。我一般是蛋白樣品+loading，剩余的用裂解液補(bǔ)齊，marker也會(huì)補(bǔ)相應(yīng)的loading。最后總體積不要太大，＜40都是可以的。

2、配膠

玻璃板一定要洗干凈，不然到時(shí)候膠不勻，跑出來(lái)波浪形的條帶也不奇怪。要想蛋白分得開(kāi)，濃度就大一點(diǎn)。如果特別著急，temed是可以多加的，有時(shí)候多加1-5都是可以的。液封用異丙醇頁(yè)面比較整齊，乙醇也是可以的，液封的時(shí)候一定要慢，加的太猛會(huì)讓你的液面一言難盡。上層膠一般2-3厘米左右，反正比梳子長(zhǎng)一點(diǎn)就可以。

3、電泳

跑膠之前先用30V左右的小電壓跑3-5分鐘，讓膠里面的離子和電泳液的一致（重要的樣用新配的電泳液，不要?。Ｉ蠘影赐w積同離子濃度跑，marker也要加loading，否則最兩邊的樣品會(huì)跑歪。

4、轉(zhuǎn)膜（得到好結(jié)果的關(guān)鍵步驟）

一定一定要避免氣泡?。。馀葜饕袃蓚€(gè)來(lái)源：（1）制作轉(zhuǎn)膜三明治的時(shí)候沒(méi)有趕盡氣泡。濾紙和膠，膠和膜，膜和濾紙之間一定要把氣泡趕盡，有氣泡就會(huì)斷路，斷路蛋白就沒(méi)法遷移到膜上。（2）從電泳液攜帶過(guò)來(lái)的小氣泡。一般電泳過(guò)的膠不要直接放轉(zhuǎn)膜液里，自來(lái)水沖洗一下，把上面的小氣泡沖掉，保證開(kāi)始轉(zhuǎn)膜時(shí)轉(zhuǎn)膜液里沒(méi)有氣泡。另外，一層一層放置膜和濾紙時(shí)，要先把濾紙或者膜的一邊放到膠上，然后緩緩把剩下的濾紙覆蓋到膠上，可以避免有氣泡。

轉(zhuǎn)膜液回收可以，但記得每次用回收的轉(zhuǎn)膜液補(bǔ)一點(diǎn)兒甲醇，增加降溫效果。

5、封閉（沒(méi)啥好說(shuō)的）

6、孵一抗

一抗很貴，所以盡量回收?？梢杂胹anta的含疊氮鈉PBS和BSA配制成5%（m/v）的一抗稀釋液，四度放置。一次可以配4-5ml，可以用2-3個(gè)月。個(gè)人感覺(jué)挺劃算（ps：用這個(gè)方法博士都只用了一支抗體，還沒(méi)用完）。

一抗的最佳工作濃度要自己測(cè)，別迷信說(shuō)明書(shū)，自己設(shè)幾個(gè)濃度梯度1：500，1：1000，1：2000，你會(huì)發(fā)現(xiàn)有的1：1000的抗體，其實(shí)用1：2000效果可能更好。另外，不是抗體越濃越好出條帶（1：5000能出的條帶，1：1000卻一團(tuán)黑），抗體濃度要摸?。。?/p>

7、孵二抗和曝光就沒(méi)什么好說(shuō)的了，基本前面的注意了，后面幾乎能出出好條帶。

暫時(shí)想到這么多，大家有不同意見(jiàn)或者更好的方法的，可以說(shuō)出來(lái)大家一起討論。

供參考。