單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了經(jīng)典霍奇金淋巴瘤腫瘤微環(huán)境中的疾病定義性T細(xì)胞亞群

題目：Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Disease-Defining T-cell Subsets in the Tumor Microenvironment of Classic Hodgkin Lymphoma
發(fā)表期刊：Cancer Discovery (IF:39.4)
發(fā)表年份：2020-03

摘要

霍奇金淋巴瘤( Classic Hodgkin Lymphoma, cHL)的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由不同類型的非惡性的免疫細(xì)胞和惡性細(xì)胞(HRS)組成的。細(xì)胞成分及其空間關(guān)系的特征對于理解TME中的 cross-talk和治療靶向至關(guān)重要。作者對22個(gè)霍奇金淋巴瘤組織標(biāo)本和5例健康對照淋巴結(jié)組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，總共包含127000多個(gè)細(xì)胞，首次在單細(xì)胞水平揭示了霍奇金淋巴瘤特異性免疫微環(huán)境的表型。單細(xì)胞表達(dá)譜確定了一種新的霍奇金淋巴瘤相關(guān)T細(xì)胞亞群，該亞群高表達(dá)LAG3，確定該LAG3+T細(xì)胞群是免疫抑制環(huán)境形成的中介物質(zhì)。微環(huán)境中免疫細(xì)胞的Multiplexed spatial assessmen評估也顯示，MHC II類缺陷腫瘤細(xì)胞附近的LAG3+T細(xì)胞增加。這些發(fā)現(xiàn)為TME生物學(xué)提供了新的見解，并為霍奇金淋巴瘤的免疫檢查點(diǎn)靶向提供了新的方法。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及質(zhì)控

結(jié)果

1.單細(xì)胞水平的cHL特異性免疫微環(huán)境

總共22例cHL患者的淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液，包括12例結(jié)節(jié)硬化（NS）亞型、9例混合細(xì)胞（MC）亞型和1例富含淋巴細(xì)胞亞型。同時(shí)還有5個(gè)健康供者的反應(yīng)性淋巴結(jié)（RLN）進(jìn)行了測序，作為正常對照）?？偣驳玫?27786個(gè)活細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞檢測到的基因數(shù)目中位數(shù)是1203。合并了所有細(xì)胞（保活cHL和RLN）的表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了批量校正和標(biāo)準(zhǔn)化。最終確定了22個(gè)細(xì)胞簇(Figure 1A),包括 na?ve T-cell clusters, two CD8+ T-cell clusters, six CD4+ T-cell clusters, seven B-cell clusters, one macrophage cluster, one plasmacytoid dendritic cell cluster, and one progenitor cell cluster.大多數(shù)免疫細(xì)胞表型在cHL和RLN之間均有所重疊，一些特定的細(xì)胞簇主要來自cHL。
Figure 1 A and B

而且，與RLN相比，3個(gè)Treg 細(xì)胞群在cHL樣本數(shù)目更多，比例更高(Figure 1 C-E)。
Figure 1 C-E

2.EBV狀態(tài)對cHL免疫細(xì)胞亞群的影響

30%至40%的cHL與EB感染HRS細(xì)胞有關(guān)，EBV感染可以招募特定的Treg群體到cHL的TME中。于是比較了5個(gè)EB+和17個(gè)EB-樣本，發(fā)現(xiàn)在EBV+cHL中，具有Th17特征的CD4+T細(xì)胞比例顯著降低（Figure 1 F and G）。然而，兩組之間的CD8+T細(xì)胞或Treg比例沒有顯著差異（Figure 1 F）。類似地，與cHL NS亞型相比，通常與EBV相關(guān)的cHL MC亞型的Th17比例較低(Figure 1 H)。
Figure 1 F and G

2.cHL特異性免疫亞群的單細(xì)胞圖譜

Figure 1B 和D 表明，與RLN相比，cHL中的Tregs較多。于是將分析重點(diǎn)放在Treg亞群上。除IL2RA（CD25）和TNFRSF18（Figure 2A）等常見Treg標(biāo)記物外，CD4-CD5-Treg亞群還高表達(dá)LAG3。然而，其他典型的Treg 細(xì)胞marker，如FOXP3在該亞群中表達(dá)較低，表明這些細(xì)胞可能是I型調(diào)節(jié)性（TrI）T細(xì)胞表型（圖2B）。為了證實(shí)cHL中免疫細(xì)胞的表達(dá)模式，還使用多色I(xiàn)HC和IMC評估了所有cHL病例中胞面和胞內(nèi)marker的表達(dá)。證實(shí)了CD4+T細(xì)胞上的LAG3和FOXP3蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。（Supplementary Figure 6 B and C）。
Supplementary Figure 6 B and C

為了進(jìn)一步了解cHL TME中抑制性受體表達(dá)的特點(diǎn)，探索了單個(gè)T細(xì)胞之間的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)有LAG3表達(dá)的細(xì)胞多來自Treg，有PD-1表達(dá)的細(xì)胞比較多來自非Treg的CD4+T細(xì)胞 (Figure 2 C). 有趣的是，CD8+T細(xì)胞（包括CTL）不是表達(dá)PD-1和LAG3的主要群體 (Figure 2 C and D)。這表明cHL中，CD4+T細(xì)胞群體對于免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)的重要性。值得注意的是，每個(gè)抑制性受體在cHL的每個(gè)T細(xì)胞亞群中的作用具有特異性(Figure 2 E)
Figure 2 C
Figure 2 D and E
大多數(shù)LAG3+T細(xì)胞共表達(dá)CTLA4，CTLA4是一種更普遍的Treg標(biāo)記，而PD-1則沒有這種現(xiàn)象（Figure 2 F）。接著使用了 diffusion map algorithm分析所有CD4+T細(xì)胞亞群的分化狀態(tài)。第一維度顯示出naive T細(xì)胞開始到Tregs T細(xì)胞的分化軌跡結(jié)束的軌跡。LAG3+T細(xì)胞在該維度的遠(yuǎn)端富集，這說明這群細(xì)胞與代表終末分化特征的基因相關(guān)。與之前的報(bào)道一致，LAG3陽性的細(xì)胞增殖活性下降，抑制活性增強(qiáng)，與G2–M細(xì)胞周期和糖酵解特征基因相關(guān)。
Figure 2 F and G

3.cHL細(xì)胞上清能誘導(dǎo)LAG3+ T Cells增殖

接著研究了LAG3+T細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)水平。在CD4+T細(xì)胞中，LAG3+T細(xì)胞的細(xì)胞因子IL10、TGFβ和IFNγ的表達(dá)高于LAG3? T細(xì)胞（Figure 3 A）。這些特征與1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特征一致。
Figure 3 A

接著假設(shè)HRS細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或趨化因子可能影響cHL的TME。評估了各種淋巴瘤細(xì)胞系的上清液對T細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響?；罨疶細(xì)胞14天后，流式證實(shí)，與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）細(xì)胞系上清液或僅培養(yǎng)基共培養(yǎng)的T細(xì)胞相比，與cHL細(xì)胞系上清液共培養(yǎng)的CD4+CD25+T細(xì)胞上表達(dá)的LAG3水平較高（Figure 3 B and C).
Figure 3 B and C
Luminex分析表明，與DLBCL細(xì)胞系相比，cHL細(xì)胞系上清液有更的細(xì)胞因子和趨化因子，包括TARC/CCL17、TGFβ和IL6，它們是已知的Treg遷移和分化增強(qiáng)劑（Figure 3 D）。與scRNA-seq結(jié)果一致，與CD4+LAG3-T細(xì)胞相比，CD4+LAG3+T細(xì)胞分泌的IL10和TGFβ數(shù)量顯著增加（Figure 3 E）。值得注意的是，體外共培養(yǎng)后，CD4+LAG3+T細(xì)胞抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，證實(shí)了LAG3+T細(xì)胞的免疫抑制功能（Figure 3 F）。
Figure 3 D-F

4.LAG3+T細(xì)胞和HRS細(xì)胞的空間評估

接下來，探究LAG3+T細(xì)胞和惡性HRS細(xì)胞之間的空間關(guān)系。病人樣本的IHC顯示，與RLN相比，cHL TME中富含LAG3+T細(xì)胞，并且在一部分cHL病例中，HRS細(xì)胞被LAG3+T細(xì)胞緊密包圍（Figure 4 A）。單細(xì)胞分析結(jié)果提示，與MHC II類陽性的HRS細(xì)胞（n=16）相比，MHC II類陰性HRS細(xì)胞（n=6）的LAG3表達(dá)顯著更高，但與EBV狀態(tài)或組織學(xué)亞型無關(guān)（Figure 4 B)。對于CD4-Treg-C5亞群，與MHC II類陽性細(xì)胞相比，MHC II類陰性細(xì)胞中LAG3上調(diào)倍數(shù)最大（Figure 4 C）。
Figure 4 A-C

IHC表明，與MHC-II陽性的樣本相比，MHC-II陰性樣本LAG3+T細(xì)胞顯著增加，F(xiàn)OXP3+T細(xì)胞減少（Figure 4 D）。多色I(xiàn)HC評估了HRS細(xì)胞和LAG3+CD4+T細(xì)胞之間的空間關(guān)系（Figure 4 E-G）。MHC-II陰性樣本HRS周圍區(qū)域的LAG3+T細(xì)胞密度顯著增加，但與MHC-I狀態(tài)、病理亞型或EBV狀態(tài)均無相關(guān)性（Figure 4 E）。同樣，在MHC-II陰性的cHL樣本中，CD30+細(xì)胞（HRS細(xì)胞）與其最近的LAG3+T細(xì)胞之間的平均最近鄰距離顯著最短（Figure 4 F）。相反，在MHC-II陽性HRS細(xì)胞的樣本中，圍繞FOXP3+T細(xì)胞的HRS細(xì)胞數(shù)目較高（Figure 4 E），HRS細(xì)胞到FOXP3+細(xì)胞的最近鄰距離也較短（Figure 4 F）。
Figure 4 E-G
為了進(jìn)一步研究HRS細(xì)胞及其周圍細(xì)胞之間的空間關(guān)系，使用IMC成像質(zhì)譜流式方法，評估所有cHL病例中表面和胞內(nèi)標(biāo)記物的表達(dá)（這個(gè)技術(shù)允許在TME的空間背景下同時(shí)可視化35個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)記物）。與IHC分析一致，MHC-II陰性cHL樣本有大量LAG3+CD4+細(xì)胞浸潤，伴有較少的FOXP3+CD4+細(xì)胞（Figure 5 A）。相反，MHC-II陽性病例顯示大量的FOXP3+CD4+T細(xì)胞和少量LAG3+CD4+T細(xì)胞。與MHC-II陽性cHL病例相比，MHC-II陰性cHL標(biāo)本中HRS細(xì)胞與LAG3+T細(xì)胞之間的最近鄰距離明顯縮短。
Figure 5 A-C
##5.在驗(yàn)證隊(duì)列中，TME中LAG3+T細(xì)胞的數(shù)量與MHC-II表達(dá)的缺失相關(guān)

接下來，使用一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列來驗(yàn)證LAG3+T細(xì)胞存在的潛在預(yù)后價(jià)值。這隊(duì)列包括166名患者，進(jìn)行了ABVD方案治療(阿霉素、博萊霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪）。與scRNA-seq的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)與MHC-II陽性HRS細(xì)胞相比，MHC-II陰性HRS細(xì)胞的腫瘤組織中LAG3+T細(xì)胞的比例顯著高于MHC-II陽性中的HRS細(xì)胞，但與EBV狀態(tài)無關(guān)（Figure 5 B and C）。此外，LAG3+T細(xì)胞數(shù)量增加與DSS和OSS縮短相關(guān)(Figure S13 A and B)。，高比例的LAG3+T細(xì)胞（>15%）和CD68+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(≥5%）通過多變量Cox回歸分析確定為DSS的獨(dú)立預(yù)后因素（MHC-II表達(dá)和IPP評分作為協(xié)變量量，F(xiàn)igure S13 C）。最后在一個(gè)獨(dú)立復(fù)發(fā)性cHL患者隊(duì)列中（這些患者在接受高劑量化療后進(jìn)行自體干細(xì)胞移植），同樣發(fā)現(xiàn)，LAG3+T細(xì)胞的增多與不良的存活率相關(guān)，盡管未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性，可能是由于樣本量太少（Figure S13 D）。


Figure S13
##6.cHL中HRS細(xì)胞與LAG3+T細(xì)胞之間的Cross-talk
cHL中HRS細(xì)胞與LAG3+T細(xì)胞之間的串?dāng)_
為了研究HRS細(xì)胞與cHL微環(huán)境相互作用，接下來探索了從原發(fā)性霍奇金淋巴瘤樣本的顯微解剖HRS細(xì)胞生成的Affymetrix基因表達(dá)數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)了MHC陰性樣本的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平較高（圖6A）。IL6是唯一一個(gè)在MHC-II陰性HRS細(xì)胞中表達(dá)顯著高于MHC-II陽性HRS細(xì)胞的細(xì)胞因子。在體外，IL6也可誘導(dǎo)CD4+LAG3+T細(xì)胞形成（Figure 6B），表明IL6可能在誘導(dǎo)cHL中的CD4+LAG3+T細(xì)胞中發(fā)揮作用。
Figure 6
為了研究LAG3+T細(xì)胞和MHC-II在HRS細(xì)胞的相互作用，在L-428 cHL細(xì)胞系中敲除CIITA基因（因?yàn)镃IITA是MHC-II表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子），并驗(yàn)證了敲除CIITA基因細(xì)胞上MHC-II呈陰性狀態(tài)（Figure S14A）。
Figure S14A
接下來，使用L-428上清液培養(yǎng)從外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中分離誘導(dǎo)的LAG3+T細(xì)胞。將LAG3+T細(xì)胞分別與野生型L-428細(xì)胞和CIITA敲除L-428共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)LAG3的表達(dá)量在MHC-II陽性的L-428細(xì)胞中下調(diào)，表明MHC-II可以跟LAG3直接相互作用負(fù)調(diào)控LAG3+T細(xì)胞(Figure 6C)。
Figure 6

7.去除LAG3+T細(xì)胞后，臨床樣本來源的T細(xì)胞被激活

為了證實(shí)LAG3+T細(xì)胞在cHL臨床樣本中的致病作用，從4名患者的細(xì)胞懸液中分離了CD4+LAG3+CD25+T細(xì)胞和剩余的T細(xì)胞。然后在體外將T細(xì)胞與CD4+LAG3+CD25+T細(xì)胞共培養(yǎng)之后，
觀察到與LAG3+細(xì)胞群共培養(yǎng)的T細(xì)胞中的增殖受到抑制，而不與LAG3+細(xì)胞群共培養(yǎng)的T細(xì)胞中，細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)，且細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子TNFα的表達(dá)顯著增加。

總的來說，MHC-II陰性HRS細(xì)胞的免疫抑制微環(huán)境是高度“有序”的，部分細(xì)胞由CD4+LAG3+T細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，而CD4+LAG3+T細(xì)胞又由HRS細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)（Figure 7）。綜合所有這些結(jié)果，作者推斷LAG3+T細(xì)胞和HRS細(xì)胞之間的串?dāng)_可能是cHL免疫逃逸的一個(gè)重要機(jī)制，對檢查點(diǎn)抑制劑治療的結(jié)果預(yù)測具有潛在意義，包括反應(yīng)持久性和克服耐藥性。
Figure 7

研究意義

由HRS細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)的LAG3+T細(xì)胞在cHL的TME中起著重要的免疫抑制作用。重要的是，LAG3是正在進(jìn)行的惡性淋巴瘤臨床試驗(yàn)（包括cHL）中的癌癥免疫治療靶點(diǎn)。該研究提示去除LAG3+群體可以作為重新激活T細(xì)胞活性的一種手段。雖然目前數(shù)據(jù)沒有證明LAG3+T細(xì)胞作為預(yù)后生物標(biāo)記物的價(jià)值，尚需要其他隊(duì)列的進(jìn)一步驗(yàn)證，但在針對LAG3+T細(xì)胞及其細(xì)胞相互作用的治療背景下，評估LAG3+T細(xì)胞作為預(yù)測性生物標(biāo)記物的潛力至關(guān)重要。特別是，正在進(jìn)行的針對CTLA4或CD25的LAG3靶向抗體和抗體-藥物結(jié)合物的試驗(yàn)（將針對LAG3+細(xì)胞等）將允許進(jìn)行這種評估。此外，對包括LAG3+T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞類型等免疫細(xì)胞相互作用生物學(xué)的進(jìn)一步研究，可能有助于未來替代檢查點(diǎn)抑制劑的治療開發(fā)。

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