遺傳轉化的基本知識(一)——基因轉化的受體

自1983年第一個轉基因植物問世以來只有20多年的時間,但植物基因工程的發(fā)展日新月異,碩果累累。將外源基因人為導入天然植物中,從遺傳物質水平上對植物進行有目的改造,由此獲得轉基因植物,其性狀將按著有利于人們需要的方向發(fā)生改變。植物基因工程具有得天獨厚的優(yōu)勢是植物細胞的“全能性”理論。這是動物細胞所不能比擬的,其次是植物基因工程不會像動物或人類基因工程那樣遇到較多的社會、倫理、道德等問題。植物基因工程為育種開辟了一條嶄新的途徑。

經(jīng)過十多年來得探索,基因轉化的技術日臻成熟,已經(jīng)形成了以農(nóng)桿菌載體轉化和基因槍轉化技術為主體的兩大植物基因轉化系統(tǒng)。這兩種轉化系統(tǒng)機理清楚、證據(jù)確鑿,成功的例子最多,約占已獲轉基因植物的90%以上。

植物基因轉化的受體:所謂基因轉化受體是指用于轉化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑,能高效、穩(wěn)定地再生無性系,并能接受外源DNA整合,轉化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。

盡管接受外源基因的受體包括葉圓片(盤)、胚性愈傷、胚狀體、愈傷組織、懸浮細胞、原生質體等不同的形態(tài),但其基本形態(tài)還是細胞。其中,葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是最簡單的轉化方法;愈傷組織的轉化效率高、生長速度快,是快速檢測外源基因表達的最好受體;原生質體則是單克隆轉化的最佳材料。

植物基因轉化的受體包括:

1、原生質體:原生質體是無細胞壁的細胞。與懸浮細胞一樣,被轉化的受體是單個獨立的細胞,為選擇遺傳均一性的轉基因植株提供了可能性。

水稻廣親和品種‘02428’的原生質體用聚乙二醇(PEG)法導入具有潮霉素B(HPT)抗性基因、卡那霉素抗性基因(KanR)和昆蟲熒光素酶基因(Luc)的質粒pTHL27DNA,在含有25μg/ml潮霉素B和100μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基KPR和N6上連續(xù)培養(yǎng)處理4周,可以很好地除去非轉化的敏感的原生細胞;然后在無抗菌素選擇壓力的培養(yǎng)基中,轉化細胞可再生植株(楊歧生等,1996)。

2、懸浮細胞:以懸浮細胞作受體的轉化方法包括農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、PEG介導法、電激法和顯微注射法等。

小麥幼胚懸浮細胞用JQ-700基因槍法轉化,得到了GUS基因瞬間表達的各項最適參數(shù)。他們還建立了‘冀谷11號’谷子幼穗的懸浮培養(yǎng)細胞系及植株再生體系。將胚性懸浮細胞系接種到MS培養(yǎng)基,20d繼代1次,直至出現(xiàn)綠芽;然后轉入無激素的MS0或1/2MS0培養(yǎng)基分化植株。以基因槍轟擊轉化懸浮細胞后,放置48h,檢測GUS短暫表達頻率TTF%為20%-40%;在添加200mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上,有5%-10%的愈傷組織具有抗性,且能穩(wěn)定傳代(董云洲等,1998)。

3、胚性愈傷組織:愈傷組織的轉化方法也適用于胚性愈傷組織。胚性愈傷組織的轉化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上獲得成功。芹菜胚性愈傷組織用根癌農(nóng)桿菌C58C1(pBZ6111)感染后,在MS+2,4-D1mg/L十KT0.1mg/L培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。在篩選到的氯霉素抗性愈傷組織中檢測到胭脂堿合成酶活性,表明外源基因已整合到芹菜細胞基因組中并得到表達??剐杂鷤M織可在無激素的基本培養(yǎng)基上增殖,但分化出的再生植株畸形(鄭世學等,1996)。

4、胚狀體

胚狀體是由愈傷組織經(jīng)過改造后分化而來的,其轉化方法也同愈傷組織。

比如:用根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白(PRSV-CP)與核酸酶(Nuclease)嵌合基因,通過振動共培養(yǎng)法轉化番木瓜子葉型胚狀體,在選擇培養(yǎng)基上篩選誘導再生轉基因植株。NPTII分析和Southernblot分子雜交結果表明,PRSV-CP-Nuclease嵌合基因已經(jīng)整合到番木瓜核基因組中(周鵬等,1995)。

5、葉圓片:葉圓片(葉盤)是農(nóng)桿菌轉化的主要受體。采取新鮮植株上無菌的幼嫩葉片,用打孔器或解剖刀切取直徑3-5mm的葉圓片,在液體培養(yǎng)瓶中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20-30min,其間輕輕搖動使農(nóng)桿菌從切口侵入葉片。然后將共培養(yǎng)后的葉圓片在濾紙上吸干,轉移到非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d,再轉入含卡那霉素或羧芐青霉素等抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),誘導植株再生,這樣可獲得遺傳均一性較高的轉基因植株。

葉盤法常見于雙子葉植物的遺傳轉化,馬鈴薯“東農(nóng)303’’的葉盤用含有質粒pPZH1和輔助質粒pGV2260雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1進行轉化,在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后,葉盤切口形成抗性愈傷組織,轉化率為4%-38%;經(jīng)NPTII酶活性分析和DNA分子雜交證實獲得了轉基因再生植株(王光清等,1994)。

6、其他受體:除了葉圓片、愈傷組織、懸浮細胞或原生質體等幾種常見的受體之外,還有多種不同類型的組織或器官可作為外源基因的受體,如:子葉、胚軸、莖段、根、體細胞胚、花粉等等。

比如將切成小段形成一定傷口的金魚草下胚軸與根癌農(nóng)桿菌LBA4404(p35SGUSINT)共培養(yǎng),通過不定芽途徑獲得抗G418的再生植株,經(jīng)DNA/DNA斑點雜交及GUS活性原位組織檢測,初步證實外源基因GUS已整合到金魚草基因組并得到表達(余迪求等,1996)。

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