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同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)院羅劍教授與上海長征醫(yī)院楊莉莉教授合作在Bone Research上在線發(fā)表了題為“Sorafenib inhibits ossification of the posterior longitudinal ligament by blocking LOXL2-mediated vascularization”的研究成果，研究闡明了后縱韌帶骨化（OPLL）過程中LOXL2 在韌帶細(xì)胞內(nèi)皮樣分化中的作用，并證實(shí)了索拉非尼對OPLL的治療干預(yù)潛力。該研究中轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析服務(wù)由元莘生物提供。

后縱韌帶骨化 （OPLL） 是一種退行性骨質(zhì)增生病，其特征是軟韌帶和彈性椎韌帶轉(zhuǎn)化為骨骼，導(dǎo)致脊柱活動受限和神經(jīng)壓迫。研究采用bulk RNA和scRNA測序獲得基礎(chǔ)研 ?究數(shù)據(jù)，在單細(xì)胞分辨率上闡明了OPLL演化過程中的細(xì)胞和分子特征，并在臨床樣本中驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)研究揭示了韌帶干細(xì)胞在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞樣表型的能力。研究將LOXL2確定為OPLL演化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。通過功能獲得和喪失研究，研究闡明了 LOXL2 在韌帶細(xì)胞內(nèi)皮樣分化中的作用：LOXL2通過HIF1A通路起作用，促進(jìn)下游VEGFA和PDGF-BB的分泌，進(jìn)而調(diào)控韌帶細(xì)胞的內(nèi)皮樣分化。此外，研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼（廣譜酪氨酸激酶抑制劑）可以有效抑制LOXL2介導(dǎo)的血管形態(tài)發(fā)生。通過破壞血管形成和成骨之間的偶聯(lián)，索拉非尼在BMP誘導(dǎo)和enpp1缺陷誘導(dǎo)的動物模型中均顯示出對OPLL進(jìn)展的顯著抑制，同時(shí)對正常骨量沒有明顯影響。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了索拉非尼作為OPLL治療干預(yù)措施的潛力。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解析骨化組中的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控路徑：研究對4名OPLL患者的韌帶樣本進(jìn)行RNA-seq分析，研究對從骨化 （OPLL） 和副骨化 （non-OPLL） 韌帶樣本中獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析揭示了與骨化組織中血管生成和血管生成相關(guān)的基因和信號通路的上調(diào)。隨后的功能喪失和獲得實(shí)驗(yàn)，提供了LOXL2 通過 HIF1A 信號通路調(diào)節(jié)韌帶細(xì)胞分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞的證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼是一種小分子抑制劑，可以抵消 LOXL2 上調(diào)導(dǎo)致的增強(qiáng)的內(nèi)皮樣分化和成骨。重要的是，通過證明索拉非尼對各種嚙齒動物模型中骨化進(jìn)展的抑制作用，我們的研究結(jié)果得到了進(jìn)一步證實(shí)。

單細(xì)胞測序揭示韌帶細(xì)胞內(nèi)皮分化軌跡，對3例退行性頸椎病患者的后縱韌帶（OPLL）和2例無骨化（non-OPLL）的患者進(jìn)行了scRNA-seq分析，獲得51245個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，注釋得到的一簇骨化韌帶細(xì)胞，具有骨相關(guān)基因（BGLAP、RUNX2、SP7）的高表達(dá))36和祖細(xì)胞特征基因PRG4，PRG4細(xì)胞是異位骨化的干細(xì)胞，通過對患者組織切片，結(jié)果顯示PRG4在骨化和非骨化連接區(qū)域表達(dá)顯著升高。OPLL中韌帶細(xì)胞的特征和細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)，進(jìn)行RNA速率分析并構(gòu)建了韌帶細(xì)胞分化為血管的演化軌跡。

LOXL2通過HIF1A通路調(diào)節(jié)韌帶細(xì)胞內(nèi)皮分化：LOXL2 過表達(dá)后毛血管結(jié)構(gòu)的形成增加，BAPN（抑制膠原蛋白賴氨酸殘基催化氧化）處理不會影響韌帶細(xì)胞中管狀結(jié)構(gòu)的形成；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示骨化韌帶組織中缺氧和血管生成通路上調(diào)；轉(zhuǎn)錄因子HIF1A是缺氧信號傳導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子，觀察到 LOXL2 （OE-LOXL2） 過表達(dá)后韌帶細(xì)胞中 HIF1A 的顯著上調(diào)，LOXL2 的過表達(dá)導(dǎo)致 HIF1A 及其下游基因 VEGFA-C 和 PDGFB 的表達(dá)增加。LOXL2通過調(diào)節(jié)HIF1A信號通路影響韌帶細(xì)胞的內(nèi)皮分化。LOXL2通過HIF1A / VEGFA途徑調(diào)節(jié)血管形成。

索拉非尼減弱BMP誘導(dǎo)的骨化發(fā)展：VEGFA單克隆抗體和VEGFR抑制劑索拉非尼對LOXL2誘導(dǎo)的韌帶細(xì)胞血管形成的影響，研究結(jié)果表明：索拉非尼作為多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑可同時(shí)抑制VEGFR和PDGFR，進(jìn)而對骨化進(jìn)程有顯著抑制作用。索拉非尼引起的血管形成和成骨的解耦會阻礙骨化的進(jìn)展。