從新生大鼠的骨骼肌中分離成肌細(xì)胞（衛(wèi)星細(xì)胞），在體外培養(yǎng)條件下，成肌細(xì)胞在培養(yǎng)底物上增殖，在誘導(dǎo)分化條件下，可遷移成直線排列，最終融合形成多細(xì)胞肌管。已有報(bào)道，將自體的骨骼肌細(xì)胞移植入心肌梗死后的瘢痕可改善心

肌功能。這些進(jìn)展激發(fā)了科研人員對(duì)體外成肌細(xì)胞增殖、分化分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究。下面將介紹新生大鼠骨骼肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及肌管誘導(dǎo)分化。該方法也可用于小鼠、兔、豬或狗等動(dòng)物骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)。

（ 一）材料與設(shè)備

1. 動(dòng)物Wistar 新生大鼠（出生24~48h) 。

2. 試劑

（1） MEM-EBSS 培養(yǎng)液，進(jìn)口優(yōu)質(zhì)胎牛血清( FBS), L－谷氨酰胺2mmol/L ,雙抗試液（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml ) ，丙酮酸鈉1mmol/L ， II 型膠原酶，D-Hanks 溶液， 0.25％胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液，馬血清( HS) 。

（2）增殖培養(yǎng)液的配制： MEM-EBSS+15%~20% FBS＋雙抗試液＋L-谷氨酰胺＋丙酮酸鈉。

（3）分化培養(yǎng)液的配制： MEM-EBSS+2%FBS+10%HS＋雙抗試液＋L-谷氨酰胺＋丙酮酸鈉。

3. 設(shè)備

手術(shù)器械，細(xì)胞篩(100 目、200 目、400 目），離心機(jī)， CO2培養(yǎng)箱， T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑60mm), 24 孔板。

（ 二） 操作步驟

1. 取24~48h 新生大鼠胸大肌及股四頭肌，用眼科剪將其剪成1mm3大小肉糜， 以D-Hanks 溶液沖洗2~3 次。

2. 以0.17％的胰蛋白酶和0.085％的 II 型膠原酶同時(shí)消化50~60min, 其間每10min 吹打1 次。

3. 離心（每分鐘1000 轉(zhuǎn)，10min) ，棄去上清液， 加入無(wú)血清的MEMEBSS培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中用20ml 注射器抽吸、吹打約10 次，以釋放骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

4 . 分別過(guò)100 目、200 目、400 目細(xì)胞篩網(wǎng)。

5. 收集細(xì)胞懸液于未經(jīng)包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中， 37 °C 靜置45 ~60min, 通過(guò)差速貼壁法，去除大部分成纖維細(xì)胞。

6. 收集未貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以每分鐘1500 轉(zhuǎn)的速率離心7min, 棄去上清液。

7. 以含15%~20%FBS 的MEM 增殖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 在24 孔板中，以每孔4x 105~6x 105個(gè)/ml 接種細(xì)胞。注意，接種密度可根據(jù)實(shí)際需求確定，每孔最少不應(yīng)低于1.5 x I05個(gè)／ml； 接種密度與更換分化培養(yǎng)液的時(shí)間有關(guān)， 接種密度越高， 更換分化培養(yǎng)液的間隔時(shí)間越短，反之亦然。

8 . 細(xì)胞貼壁并增殖20~36h （根據(jù)接種密度決定），待細(xì)胞至60%~70％匯合時(shí)，可更換含2 % FBS 和10 %HS 的MEM 分化培養(yǎng)液，之后每24~48h更換1 次分化培養(yǎng)液 。

9. 每孔以1.5x 105個(gè)/ml 的密度接種，可于3~4d 時(shí)出現(xiàn)肌管。注意，接種密度可影響肌管形成的時(shí)間及形態(tài)，接種密度越高，肌管形成越早，肌管數(shù)量越多，肌管越粗大。

（三）細(xì)胞鑒定

肌絲蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性。

（四）小結(jié)

組織以酶消化后，輕微機(jī)械研磨使肌纖維分離，釋放出成肌細(xì)胞。不加誘導(dǎo)分化條件，體外可傳代4 次。