A genomewide transcriptomic approach identifies a novel gene expression signature for the detection of lymph node metastasis in patients with early stage gastric cancer
全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法確定了檢測(cè)早期胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新基因表達(dá)特征
發(fā)表期刊：EBioMedicine
發(fā)表日期：2019 Mar
DOI:? 10.1016/j.ebiom.2019.01.057
一、背景
????????淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LN）是影響胃癌（GC）患者預(yù)后不佳的主要因素之一。因此，在治療前準(zhǔn)確識(shí)別LN狀態(tài)，特別是在早期階段（粘膜和粘膜下），是改善患者的治療策略和生存結(jié)果的關(guān)鍵。
????????近幾十年來(lái)，一些基于基因表達(dá)的分類器已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)，作為診斷和預(yù)測(cè)工具用于各種類型的癌癥。例如，Oncotype DX是一種商業(yè)化的測(cè)試，包括對(duì)預(yù)測(cè)乳腺癌和結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一組基因的分析。類似的基于基因表達(dá)的預(yù)后和預(yù)測(cè)分類法也被開發(fā)出來(lái)用于GC患者；然而，它們的臨床作用有限。
二、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
1）TCGA數(shù)據(jù)：RNA-seq數(shù)據(jù)測(cè)量了20531個(gè)基因的表達(dá)水平，并在基因水平RSEM文件中進(jìn)行了比例估計(jì)，這些基因通過乘以10轉(zhuǎn)換為TPM（每百萬(wàn)的轉(zhuǎn)錄本）6，然后對(duì) log2 進(jìn)行轉(zhuǎn)換。ACRG （GSE62254）數(shù)據(jù)集是使用R中的生物導(dǎo)體包“GEOquery”直接從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)以處理形式從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的。
2）為了進(jìn)行臨床驗(yàn)證，檢查了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立的T1和T2早期GCs患者隊(duì)列的248個(gè)組織標(biāo)本，它們被稱為臨床隊(duì)列-1（測(cè)試隊(duì)列）和臨床隊(duì)列-2（驗(yàn)證隊(duì)列）；包括來(lái)自LN陽(yáng)性（LNP）和LN陰性（LNN）患者的50份和198份未經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本。
????????由于GC診斷和治療決策主要在內(nèi)鏡切除后決定，考慮到在內(nèi)鏡檢查期間這些病變可能被低估，還納入了T2病變。在對(duì)手術(shù)組織進(jìn)行病理學(xué)復(fù)查后診斷淋巴血管浸潤(rùn)，并從各參與機(jī)構(gòu)收集血清癌胚抗原（CEA）和癌癥抗原（CA）19-9水平的數(shù)據(jù)。
2.實(shí)驗(yàn)流程
1）生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)：基于TCGA數(shù)據(jù)集中T1患者標(biāo)本的RNA-Seq數(shù)據(jù)對(duì)5個(gè)LNP和13個(gè)LNN GC患者之間差異表達(dá)的15個(gè)基因進(jìn)行了優(yōu)先排序；用這15個(gè)基因作為協(xié)變量建立了一個(gè)多變量邏輯回歸模型；數(shù)據(jù)驗(yàn)證。
2）臨床驗(yàn)證：分析了兩個(gè)大型的獨(dú)立患者隊(duì)列，以驗(yàn)證在發(fā)現(xiàn)階段確定的15個(gè)基因特征
3）RNA分離和定量反轉(zhuǎn)錄PCR
4）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：Wilcoxon's signed-rank檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；從15個(gè)基因的多變量邏輯回歸模型中得出的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)被用來(lái)繪制接受操作特征（ROC）曲線并計(jì)算曲線下的面積（AUCs）
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01、在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新型基因表達(dá)特征
????????為了確定能夠幫助診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的基因，作者首先分析了18名早期T1癌癥患者的RNA-seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)，這些患者的LN轉(zhuǎn)移陽(yáng)性或陰性。在總共20531個(gè)基因中，有84個(gè)基因在5個(gè)淋巴結(jié)陽(yáng)性（LNP）和13個(gè)陰性（LNN）患者之間存在差異表達(dá)（圖1a）。為了確定一個(gè)強(qiáng)大的候選基因特征，通過過濾低表達(dá)的基因，將基因列表進(jìn)一步縮小到15個(gè)。使用多元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)這15個(gè)候選基因能夠成功區(qū)分訓(xùn)練集中的LNP和LNN GC患者（AUC = 1.000，圖1b）。
????????鑒于有多個(gè)由T2 GC患者組成的公共數(shù)據(jù)集，作者接下來(lái)研究了T1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GC基因特征是否也能在這些額外的患者群中識(shí)別LN狀態(tài)。在TCGA隊(duì)列的96名T1和T2患者的擴(kuò)大集合（AUC =0.839，圖1c），以及在188名T2患者的ACRG隊(duì)列中（AUC =0.829，圖1d）中，基因能夠區(qū)分LNP和LNN患者。這些數(shù)據(jù)突出了新型15基因在識(shí)別早期胃癌患者LN轉(zhuǎn)移中的診斷潛力。
02、驗(yàn)證和建立用于檢測(cè)胃癌患者淋巴結(jié)狀態(tài)的15個(gè)基因特征
????????接下來(lái)，通過qRT-PCR對(duì)臨床隊(duì)列-1（n = 101）中的24個(gè)LNP和77個(gè)LNN組織標(biāo)本評(píng)估了15個(gè)基因組合的診斷準(zhǔn)確性。雖然單個(gè)基因的預(yù)測(cè)能力有限，但各種基因的組合在識(shí)別GC患者的LN轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出明顯的檢測(cè)能力。利用多元Logistic回歸分析，得到了15個(gè)基因特征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式如下，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=1.300-（0.233 × C5AR1）-（0.274× CD83）+（0.048 × ETV4）-（0.213 × FAM13A）+（0. 207 × FKBP10）-（0.227× GPRIN3）+（0.052 × LCK）+（0.124 × NR4A2）+（0.402 × PRSS21）+（0.035× RGPD1）-（0.196 × SLC2A3）-（0.212 × SLFN2）+（0.174 × TEM86B）-（0.118× TRPV4）-（0.075 × YBX2）。盡管每個(gè)單獨(dú)的基因的性能并不明顯，但在這個(gè)測(cè)試隊(duì)列中，使用這個(gè)公式為患者確定的LN轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)顯示了強(qiáng)大的診斷性能（AUC = 0.765，圖2a）。
????????值得注意的是，在識(shí)別LNP患者方面，15個(gè)基因特征與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CEA和CA19-9（圖2b）相比有明顯優(yōu)勢(shì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這15個(gè)基因特征的診斷效率，作者接下來(lái)使用多元Logistic回歸分析，在一個(gè)由26名LNP和121名LNN T1 GC患者組成的獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中檢查其性能。與測(cè)試隊(duì)列的結(jié)果一致，15個(gè)基因特征再次能夠有力地區(qū)分LNP和LNN早期GC患者（AUC=0.742，圖2b）。
03、15個(gè)基因簽名在胃癌患者的LN轉(zhuǎn)移檢測(cè)中表現(xiàn)優(yōu)于傳統(tǒng)的診斷方法
????????通過多變量分析，作者證明了15個(gè)基因特征能夠成功地檢測(cè)出LN轉(zhuǎn)移，而不受術(shù)前臨床因素如年齡、性別、腫瘤標(biāo)志物和計(jì)算機(jī)斷層掃描確定的臨床LN狀態(tài)影響（Table 3）。為了進(jìn)一步評(píng)估這一特征的意義，接下來(lái)比較了15-基因特征與各種術(shù)前臨床因素（包括腫瘤標(biāo)志物和臨床LN狀態(tài)）的診斷潛力。發(fā)現(xiàn)15-基因特征的診斷價(jià)值明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，包括循環(huán)CEA水平和CA19-9（圖2b）。
????????此外，為了評(píng)估15-基因特征的性能，作者將其性能與驗(yàn)證隊(duì)列中的患者術(shù)前診斷性CT掃描確定的臨床N期進(jìn)行了比較。與CT成像數(shù)據(jù)相比，基因表達(dá)特征在識(shí)別LN轉(zhuǎn)移的存在方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)越的準(zhǔn)確性（AUC = 0.742，圖2c），后者的AUC僅為0.595。
04、15個(gè)基因特征與其他臨床病理特征相結(jié)合，進(jìn)一步提高了胃癌患者LN轉(zhuǎn)移檢測(cè)的診斷準(zhǔn)確性
????????接下來(lái)探索將15-基因特征與目前使用的臨床病理因素（如年齡、性別、腫瘤標(biāo)志物和使用多變量邏輯回歸分析的臨床N期）結(jié)合起來(lái)，是否會(huì)進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確性。與單獨(dú)使用15-基因特征相比，將基因表達(dá)特征與臨床N期相結(jié)合，確實(shí)顯著提高了生物標(biāo)志物在識(shí)別LNP胃癌病例方面的鑒別準(zhǔn)確性（AUC=0.789）（圖2d）。
四、結(jié)論
????????作者開發(fā)了一個(gè)新的15-基因特征，有可能用于識(shí)別早期GC患者的LN轉(zhuǎn)移。在前瞻性臨床隊(duì)列中得到進(jìn)一步驗(yàn)證之前，這些標(biāo)志物為識(shí)別胃癌患者的LN轉(zhuǎn)移提供了很好的潛力。
