簡(jiǎn)介和前期文章
我對(duì)之前的所有教程進(jìn)行了再次詳細(xì)的總結(jié)
CRISPR-Cas9基因編輯之背景介紹及gRNA設(shè)計(jì)（上）
前言：
在上一次文章中，我們已經(jīng)得到了在線工具設(shè)計(jì)的sgRNA序列，經(jīng)由簡(jiǎn)單評(píng)估后選擇出合適的sgRNA
1. 使用Snapgene anneal oligo
以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 為案例，根據(jù)給出的PTEN sgRNA，完善oligo序列，并再Snapgene軟件中匹配出來
使用Snapgene一鍵生成oligo，Actions--Anneal Oligos
粘貼事先準(zhǔn)備好的序列--保存Oligo文件
2. 使用Snapgene模擬插入質(zhì)粒后的情況
（1）打開一個(gè)pSpCas9質(zhì)粒--actin--restriction cloning--insert fragment
（2）在Vector選項(xiàng)卡，選擇內(nèi)切酶為BbsI，在insert部分選擇上一步中保存好的oligo，最后點(diǎn)擊clone，保存DNA文件。
（3）打開插入后的質(zhì)粒圖譜，檢查oligo插入情況，無誤后可提交上表中的PTEN-Oligo.Top/Bottom至公司合成。
3. 設(shè)計(jì)檢測(cè)所需引物
這里檢測(cè)所用的引物和平時(shí)做PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)的引物是不同的，這里的PCR產(chǎn)物必須覆蓋基因編輯的位置，且產(chǎn)物要足夠長，至少500 bp。在這里我們以P53為例子：
（1）找到包括sgRNA序列的前后1000個(gè)堿基的序列（2000 bp）
（2）將找到的序列復(fù)制粘貼到blast中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
設(shè)置參數(shù)
（3）得到結(jié)果（小測(cè)試，為何得到的引物只有兩對(duì)，而且似乎有一對(duì)還偏離中心很遠(yuǎn)，請(qǐng)問應(yīng)該如何設(shè)置，使得產(chǎn)物聚集在中心？）
（4）查看引物基本情況，檢查無誤可提交公司合成
結(jié)語：以上，我們則是完成了sgRNA及引物設(shè)計(jì)，提交公司合成，拿到之后則可開始正式實(shí)驗(yàn)了，感興趣的同學(xué)，可以完成上面的小測(cè)試，有問題請(qǐng)?jiān)谙路搅粞?，拜拜~
