最近要提取組織RNA，上網(wǎng)看了下其他前輩的經(jīng)驗貼，現(xiàn)將丁香園“丁香師兄”的經(jīng)驗貼整理如下。原文鏈接https://www.biomart.cn/experiment/443/448/2282643.htm，有刪減
--自己的一些經(jīng)驗--
之前都是在提細(xì)胞的RNA，用量一般是細(xì)胞瓶/6孔板的一個孔用1ml，12/24孔板用0.5。
彩艷姐的意思是，這個用量是足夠多的，一般就按照這個量來加就可以了。后續(xù)異丙醇等按照trizol的用量來加。
操作過程中都是無酶的用具，冰上操作。
看完了丁香師兄的protocol和經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)了自己之前忽略的幾個點：
①防止內(nèi)源RNA酶的降解很重要，細(xì)胞要放在冰上，組織在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化凍
②足量trizol可防止組織中內(nèi)源性RNA酶降解RNA，充分研磨對于防止RNA降解也是類似的道理
③最后一步酒精洗滌可多加，充分反應(yīng)，把RNA彈起來
關(guān)于配套試劑
Trizol 法提取 RNA 是要用到氯仿、異丙醇和乙醇的。氯仿遇光易分解，異丙醇雖然沒有特殊說明，但我查的據(jù)說也是最好避光保存，不過這種試劑都是棕色瓶子，能遮蔽大部分的光線了。
關(guān)于實驗時的防護(hù)：
RNA 很容易降解，所以實驗時一般都要求口罩帽子的，避免組織的污染。不過以我的經(jīng)驗，好像內(nèi)源性的 RNA 酶才是最主要的，也就是組織內(nèi)本身的 RNA 酶。開始我是很小心，但是提取出來發(fā)現(xiàn)還是降解了，后來有經(jīng)驗了，即使組織掉在地上，拿回去繼續(xù)提也沒問題（前提是不能化凍）。所以最最重要的是組織在液氮研磨成粉末并加 Trizol 之前不能化凍，這也是 fast200 法提取效果不好的原因（fast200 法一般不用液氮研磨）。
關(guān)于液氮研磨
萬事開頭難，液氮研磨是最開始的步驟，也是最辛苦的步驟。很多女孩子都怕液氮，畢竟是零下近 200 度的東西，當(dāng)然不是鬧著玩的。不過只要小心操作，一般沒啥問題，我提了一個多月的 RNA，對液氮是很親切了，呵呵。我是找了一個保溫杯，倒出一些液氮，然后再往研缽里倒。研磨的時候多加幾次液氮，組織會慢慢變脆，就會好研一些，對于一些含水量比較大，很硬的組織，我是準(zhǔn)備了刀片，切成小塊后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉狀，但至少得看不到明顯的顆粒，這樣 Trizol 才能充分和組織接觸，快速裂解組織，也能防止組織的降解（Trizol 內(nèi)含 RNA 酶抑制劑）。
關(guān)于組織量
研磨前最后稱一下組織的重量，畢竟 1 ml 的 Trizol 最多只能裂解 100 mg 的組織。Trizol 里面是含有 RNA 酶抑制劑的，如果組織過量，Trizol 無法完全浸潤組織無法完全裂解組織，多余組織內(nèi)的 RNA 酶等物質(zhì)會導(dǎo)致 RNA 的降解。這是 RNA 降解的很重要的原因。
關(guān)于提取步驟
標(biāo)準(zhǔn) Trizol 提取步驟為 液氮研磨--加入 Trizol 裂解--加入氯仿抽提--離心--加入氯丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心。
因為提取的組織，在加入 Trizol 后增加了一步簡短的離心，可以幫助去掉一些無法降解的組織，比如纖維和雜質(zhì)之類，然后取上清再加入氯仿，可以幫助提高氯仿的效率。然后就是在加入 Trizol 后，可以將裂解液放到-80 凍存半小時以上，據(jù)說凍融過程中可以再次幫助更加充分的裂解細(xì)胞，分離蛋白和 RNA。我試了一下，的確有效果。
關(guān)于個步驟的時間
標(biāo)準(zhǔn)的時間是：
a. 液氮研磨（沒時間要求，只要組織不化就好, 我一般一個組織十分鐘左右，女孩子可能時間長一些，畢竟體力活）
b. 加入 Trizol 裂解 5-10 分鐘（我覺得還是 10 分鐘比較好，有人說這步要放在冰上，但是我的經(jīng)驗室溫就可以，室溫更有利于 Trizol 完全發(fā)揮作用，而且畢竟 Trizol 含有 RNA 酶抑制劑，不用擔(dān)心 RNA 降解）
c. 加入氯仿室溫靜置 15 分鐘（國產(chǎn)試劑真是坑爹啊，說明書把這步時間縮短到 3 分鐘，出來效果奇差）
d. 離心 15 分鐘，這是管見的一步，離心后分成三層，RNA 在上清里，所以離心管從離心機(jī)拿出來的時候要輕巧，以免管內(nèi)物質(zhì)震蕩導(dǎo)致下層沉淀激起。吸取上清的時候一定一定輕，切忌吸取太多，少量即可，洗到 400-500ul 就 OK 了，再多就容易碰到下層沉淀了。
e. 加入異丙醇靜置 10 min，然后離心 10 min。
f. 用 75% 酒精洗滌沉淀，幫助分離剩余的有機(jī)試劑（剩余有機(jī)試劑過多會影響 OD 值和 PCR反應(yīng)），所以酒精盡量多加一些，一般說明書沒有說明這一步的時間，只是說劇烈渦旋震蕩，我的經(jīng)驗是一定把沉淀彈起來，讓浮在酒精中，然后放 1-2 min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機(jī)試劑，然后再離心。
g. 加入 DEPC 處理水，組織提取出來的量還是挺大的，雖然不是很純，所以溶解液還是不能太少，至少要 50ul，之前一個大姐給我說加 20ul 就可以，結(jié)果濃度直接高得光度計測不出來了。而且濃度太高跑電泳時也跑不開，沒法鑒定。
