原代培養(yǎng)即直接從有機體取下細胞、組織或器官，讓它們在體外維持與生長。原代培養(yǎng)的特點是細胞或組織剛離開機體，它們的生物性狀尚未發(fā)生很大的改變，在一定程度上可反映它們在體內的狀態(tài)，表現(xiàn)出來源組織或細胞的特性，

因此用于藥物實驗，尤其是藥物對細胞活動、結構、代謝、有無毒性或殺傷作用等，是極好的工具。常用的原代培養(yǎng)法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。

（一）組織塊培養(yǎng)法

許多實驗室喜歡用組織塊培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)，因為方法簡單，細胞也較容易生長。尤其是培養(yǎng)心肌，有時還可觀察到心肌組織塊搏動。細胞從組織塊邊緣向外長出并鋪滿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶后， 即可進行傳代。

1. 設備材料

培養(yǎng)箱、冰箱、超凈工作臺／無菌間、無菌吸管、離心管、酒精燈、試管架、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、消化液、基礎培養(yǎng)液、胎牛血清、Hanks 溶液、雙抗試液、剪刀、攝子、小燒杯。

2. 操作步驟

（1） 在無菌條件下，取待培養(yǎng)的組織適量，置入小燒杯中， 以適量Hanks 溶液清洗2~3 次，去掉組織塊表面的血污。

（2）用眼科剪將組織塊反復剪成0.5~ 1mm3的小塊。

（3）再用Hanks 溶液反復漂洗， 直至液體不混濁為止。等組織塊下沉，將燒杯傾斜，用小吸管盡量吸除Hanks 溶液。

（4）用含20%滅活血清及雙抗溶液(200U/ml 青霉素、200μg/ml 鏈霉素）的培養(yǎng)液再清洗，用吸管吸干后加入5ml 含20％血清的培養(yǎng)液。

（5）用彎頭吸管吸取組織小塊，均勻地置于培養(yǎng)皿內表面，吸去多余的培養(yǎng)液，各組織小塊之間相距0.5cm 為宜。蓋好培養(yǎng)皿蓋，做好標記， 置37°C 的CO2培養(yǎng)箱內。

（6） 2~4h 后，于超凈工作臺中，緩緩地向培養(yǎng)皿中加入上述含20％血清及雙抗溶液( 100U/ml 青霉素及100μg/ml 鏈霉素）的培養(yǎng)液少量，以使組織塊浸沒在培養(yǎng)液中。

（7）輕輕地將培養(yǎng)皿及組織塊移至CO2培養(yǎng)箱， 如無特殊情況，不必觀察。1~2 周后，可觀察到細胞從組織塊邊緣長出，形成生長暈。

（9） 一般說來，若培養(yǎng)液無明顯改變， 1 周換液1 次即可。待細胞長滿整個培養(yǎng)皿內表面，即可進行傳代培養(yǎng)。

3. 需要說明及注意的問題

（1） 如果是用培養(yǎng)瓶而不是培養(yǎng)皿，則接種組織塊千培養(yǎng)瓶底壁后， 要輕輕地翻轉培養(yǎng)瓶，令瓶底在上，蓋好瓶蓋后輕輕置入37°C 的CO2培養(yǎng)箱， 2~4h 后，取出培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺內打開瓶蓋，仍令組織塊在上方。在組織塊對面瓶壁加入適量上述培養(yǎng)液。然后，輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，讓組織塊浸沒于培養(yǎng)液中。蓋好瓶蓋后放回二氧化碳孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)。

（2） 從培養(yǎng)皿表面游離下來的組織塊，棄去即可。

（3） 如果使用玻璃培養(yǎng)瓶，而不是新的塑料培養(yǎng)瓶，則最好在玻璃底表面包被大鼠鼠尾膠原，這樣不但有利于組織塊的黏附，而且可使細胞生長得更好。

（4）本方法適于各種組織的培養(yǎng)，操作者還可根據(jù)自己的實驗需要和細胞種類加以修改。

（二）消化培養(yǎng)法

它與上述組織塊培養(yǎng)法的主要區(qū)別有2

點。一要用酶制劑（最常用的是胰蛋白酶）處理組織塊，除去細胞間質，使細胞相互分離，形成細胞懸液；二細胞生長方式多為單層( monolayer )

。本方法的優(yōu)點在于單層細胞更易攝取營養(yǎng)、排出代謝產物，因此生長較快，可較快地應用于實驗研究；缺點是步驟頗為繁瑣，操作不慎易污染。此外，消化處理要恰到好處，不然對細胞會有一定的損傷作用。

1. 操作程序

（1） 在無菌條件下， 取待培養(yǎng)的組織1cm3左右，置入平皿或燒杯中，以適量Hanks 溶液消洗3 次，去掉組織塊表面的血污及結締組織。

（2）以鋒利的眼科剪將組織塊反復剪碎，得到約0.5mm x 1mm 大小的小塊。

（3）以Hanks 溶液沖洗數(shù)遍，稍候組織塊下沉，吸除Hanks 溶液。

（4）用少量Hanks 溶液，將組織小塊吸入預先置有無菌的磁力攪拌子的錐形燒杯中，再加入15~30ml 上述胰蛋白酶消化液。

（5）將錐形燒杯用橡皮塞蓋緊，外封以錫箔。然后移至預先置入37°C 培養(yǎng)箱內的電磁攪拌器上。

（6）打開攪拌器的電源開關，使攪拌子旋轉， 關好培養(yǎng)箱，讓胰蛋白酶進行消化。

（7）在消化過程中，每隔一定時間吸取消化物滴于載片上，于光學顯微鏡下觀察，檢查細胞是否分散成單個。若大部分細胞已分散，立即加入適量Hanks 溶液，終止消化。通常需消化10~20min 。

（8）先以100μm 不銹鋼篩過濾，濾去未消化的組織塊或大細胞團（如獲得的細胞量少，這些組織塊可繼續(xù)進行消化，以便取得較多細胞）。繼以20μ 不銹鋼篩過濾。

（9）將取得的濾液進行低速（每分鐘500~ 1000 轉）離心5min，吸除上清液。并用Hanks 溶液離心清洗1~2 次，最后加入含血清的培養(yǎng)液，攪勻，制成細胞懸液。

（10）用計數(shù)板計數(shù)，確定細胞懸液濃度，通常以1×105~3×105個接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。

2. 需要說明及注意的問題

（1） 用何種酶進行消化可視所培養(yǎng)細胞而定，除胰蛋白酶外，常用1 型膠原酶消化睪丸支持細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞；用II 型膠原酶消化大鼠腺垂體細胞等。

（2）如果沒有不銹鋼篩， 可用4 層紗布代替，但紗布要預先經高溫高壓滅菌。

（3） 嚴格地說，原代培養(yǎng)是指未經傳代的細胞，但在實際工作中，人們常將10 代以內的細胞用作原代培養(yǎng)細胞，因為此時的細胞基本上保持著原有的生物學特性。

（4） 從原代培養(yǎng)的操作步驟不難看出，原代細胞中含有多種細胞成分，即它們是異質型( heterogeneity) 的群體，因此在設計實驗及分析結果時，切勿忘記這一因素。