一、實(shí)驗(yàn)目的
? ? 掌握蛋白類藥物SDS-PAGE法檢測分子量和純度的原理和方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
? ? SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS-PAGE)，也叫變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種含有蛋白變性劑SDS（十二烷基硫酸鈉）的常用電泳技術(shù)，常用于檢測蛋白質(zhì)。
? 聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE一般采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，即含有不同孔徑的兩層凝膠：上層膠（5%濃縮膠）和下層膠（分離膠），濃縮膠孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速率相同，較稀的樣本經(jīng)過濃縮膠的遷移作用被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶，當(dāng)進(jìn)入小孔徑的分離膠后，不同大小蛋白質(zhì)由于所帶電荷不同，表現(xiàn)出不同的遷移率，由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，使不同蛋白質(zhì)在同一電場中能夠有效的分離。
? 蛋白樣品電泳前，需與上樣緩沖液（Loading Buffer）混合后煮沸處理，上樣緩沖液中含有強(qiáng)還原劑（DTT或2-Me）和蛋白變性劑SDS，破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)解聚成多肽鏈，并將SDS包覆在肽鏈表面，SDS帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，使蛋白帶有一致的負(fù)電荷（約2個(gè)氨基酸一個(gè)SDS）和一致的形狀（棒狀），消除了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是與分子量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度主要取決于分子大小。
? 通過將未知分子量蛋白和多種已知分子量蛋白一起電泳，對比其遷移速度，推算出未知蛋白的分子量近似值。多種已知分子量蛋白稱為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，也叫蛋白Marker，市面上有成品銷售，本實(shí)驗(yàn)采用多色預(yù)染Marker，也稱彩虹Marker。
三、儀器與試劑
1. 試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、電泳級(jí)SDS、丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺）、四甲基乙二胺（TEMED）、甲醇、過硫酸銨（AP）、考馬斯亮藍(lán)R250、冰乙酸、純化水、6X Loading Buffer、10 kDa-180 kDa蛋白Maker；
? ? 1×電泳緩沖液、10% SDS、30%丙烯酰胺、1M Tris-HCl（pH=6.8）、1.5M ?Tris-HCl（pH=8.8）、脫色液、10% 過硫酸銨（AP）、考馬斯亮藍(lán)染色液、目的蛋白樣本。?
2.材料：燒杯、不銹鋼盆、EP管、防爆夾、浮漂、加樣槍及槍尖、量筒、吸量管、10mL離心管。
3.儀器：FA2004N型電子天平、DYY-8C型電泳儀、DYY-BC型垂直電泳槽、制膠器、微波爐、電磁爐、純水機(jī)。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1．配液：根據(jù)用量，按照《附錄：SDS-PAGE法檢測分子量試劑配方》進(jìn)行配制。
2．制膠
? ? 垂直電泳槽的玻璃板清洗干凈后，將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃板放入電泳槽支架內(nèi)（短玻璃朝里），并將電泳槽支架在桌面水平輕輕磕幾下，使玻璃板底部對齊，然后插入斜插板到適中程度，并將其固定在制膠器上，按照配方配制10%的分離膠10mL（2塊膠），和4mL 5%的濃縮膠（2塊膠），分離膠加入TEMED后立即混勻，迅速沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡，給濃縮膠留出約2 cm的空間。在丙烯酰胺溶液上緩慢覆蓋純化水進(jìn)行壓實(shí)，防止空氣擴(kuò)散到凝膠中抑制聚合作用，并保證凝膠表面水平。在室溫條件下，凝膠應(yīng)在30min左右聚合完成，聚合后凝膠和上層液相之間可見折射率的變化。
? ? 倒掉覆蓋層純化水，并用濾紙條吸凈殘留的水，注意勿破壞凝膠表面，濃縮膠中加入TEMED，混勻后迅速加在分離膠上，并立即插入干凈的加樣梳，注意不要混入氣泡。約30min濃縮膠聚合后，拆下制膠器，放入電泳槽內(nèi)，在兩片玻璃板中間加注1×電泳緩沖液后小心移去梳子，避免破壞加樣孔，加樣梳取出后，一定要觀察凝膠梳齒是否歪斜，如有歪斜，需要用注射器針頭或者接種針將其擺正。最后再加入少量電泳緩沖液，使玻璃板內(nèi)緩沖液呈滿溢狀態(tài)，外周電泳液深度約2-3 cm左右即可。
3．制樣
? 將目的蛋白樣品（約1mg/mL）于-20℃冰箱中取出，室溫融化后混合均勻，取出25μL置于一新1.5mL EP管內(nèi)，加入5μL ?6X Loading Buffer，混合均勻，蓋上管蓋，并在管蓋上標(biāo)記好組別，用防爆夾夾住管口，插入到浮漂孔內(nèi)，100℃煮沸5?- 15 min，本實(shí)驗(yàn)采用的蛋白Marker為預(yù)處理樣本，不需要此煮樣操作。
4．加樣
? 電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液沒過加樣孔，傾斜整個(gè)裝置以趕走凝膠下面可能留有的氣泡，按預(yù)定順序加樣，每孔加入20μL，在蛋白Marker孔中加入5μL蛋白Marker。
5．電泳
? 加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，設(shè)置恒壓80V（電壓調(diào)80V，電流調(diào)最大）20min，樣品中的溴酚藍(lán)指示劑壓縮成一條直線且到達(dá)分離膠后，調(diào)節(jié)恒壓120V 約1h 40min（或200V 30-40min），當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠前沿時(shí)關(guān)閉電源停止電泳。從電泳裝置上卸下玻璃板，用卡片剝下凝膠后切除一角以標(biāo)注凝膠方位（或?qū)?/span>Marker孔設(shè)置在前面）。
6．染色
? 將凝膠沖洗后浸泡在染色液中，置于搖床上37℃染色2h或者室溫染色過夜（快速染色可用微波爐煮沸后靜置10min，2-3次重復(fù)），染色液可回收重復(fù)利用。
7．脫色
? 染色結(jié)束后，將凝膠漂洗后浸泡在脫色液中，置于搖床上脫色過夜，其間更換脫色液3次；或采用快速脫色，微波爐煮沸后靜置15min，3-4次重復(fù)，每次均換新脫色液。直至蛋白條帶清晰為止。
8．分子量
? 將顯示蛋白條帶的凝膠拍照，采用凝膠呈像系統(tǒng)軟件計(jì)算分子量和純度，并粘貼實(shí)驗(yàn)結(jié)果照片。
五、注意事項(xiàng)
1．實(shí)驗(yàn)中大部分試劑具有毒性，操作時(shí)應(yīng)戴上手套，注意防護(hù)；
2. 制膠前玻璃板位置不要歪斜，旋緊旋鈕時(shí)需要兩側(cè)同時(shí)用力，防止漏膠；
3. 制膠時(shí)TEMED最后加入，加入后立即進(jìn)行制膠，防止凝固太快導(dǎo)致制膠失?。?/span>
4. 制膠時(shí)待膠凝固后再進(jìn)行下一步操作，凝固時(shí)間一般為30min，但室溫低時(shí)可能會(huì)延長；
5. 加樣梳取出后，一定要觀察凝膠梳齒是否歪斜，如有歪斜，需要用注射器針頭或者接種針將其擺正；
6. 制樣時(shí)一定要用防爆夾夾牢EP管，防止煮沸過程中管蓋爆開導(dǎo)致樣品損失；
7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20存放數(shù)月，但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)降解；
8.上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相鄰加樣孔，蛋白Marker孔不要設(shè)置在中間，防止分不出凝膠正反面；
9.為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳；
10.電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向泳動(dòng)。
六、思考題
? 制膠時(shí)加入TEMED作用是什么？為何最后加入？
附錄：SDS-PAGE法檢測分子量試劑配方
1.10% SDS：10g SDS，加純化水定容至100mL。
2.30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺1g，加純化水定容至100mL。
3.1M Tris-HCl（pH=6.8）：將24.22g Tris用純化水溶解，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=6.8，純化水定容200mL。
4.1.5M Tris-HCl（pH=8.8）：90.85g Tris用純化水溶解，加濃鹽酸調(diào)pH=8.8，純化水定容至500mL。
5.10% 過硫酸銨（AP）：2g過硫酸鈉，加純化水定容至20mL，1mL/支分裝，-20℃凍存。
6.5×電泳緩沖液：15.1gTris堿，94g甘氨酸，5g電泳級(jí)SDS，加純化水溶解后定容至1000mL，用前5倍稀釋。
7.考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 ?0.5g，加入甲醇 150mL，冰乙酸 50mL，研磨溶解，濾紙過濾后，加純化水定容至500mL。
脫色液：冰醋酸 100mL，甲醇 300mL，加純化水定容至1000mL。
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