前列腺癌是全球男性中常見的惡性腫瘤，尤其在進(jìn)入去勢(shì)抵抗性（CRPC）階段后，治療選擇有限，預(yù)后較差。Wnt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，但因其廣泛參與正常生理過程，全面抑制常伴隨嚴(yán)重毒性。因此，尋找在前列腺癌中特異性高表達(dá)、可靶向的Wnt通路組件，成為研究焦點(diǎn)。華盛頓大學(xué)泌尿外科和干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究所團(tuán)隊(duì)通過人激酶CRISPR敲除文庫(kù)篩選結(jié)合多維度驗(yàn)證，揭示FZD6作為晚期前列腺癌高表達(dá)且高頻擴(kuò)增的Wnt受體，其靶向抑制可通過多重機(jī)制抑制腫瘤進(jìn)展，并發(fā)現(xiàn)FZD6缺失與PKMYT1抑制劑的協(xié)同治療潛力。海星生物（HySigen）依托自主研發(fā)的CRISPRSeek?文庫(kù)篩選平臺(tái)，提供高效、精準(zhǔn)的CRISPR文庫(kù)篩選服務(wù)，從文庫(kù)設(shè)計(jì)、病毒包裝到高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)深度解析全流程賦能，助力科研人員快速挖掘腫瘤關(guān)鍵靶點(diǎn)與協(xié)同治療策略。
一、核心研究方法?
1.臨床相關(guān)性評(píng)估體系
研究團(tuán)隊(duì)首先通過TCGA、SU2C/PCF等大規(guī)模前列腺癌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合Gleason評(píng)分系統(tǒng)，對(duì)10種FZD受體的表達(dá)譜和遺傳變異進(jìn)行立體化分析。在細(xì)胞模型層面，采用qRT-PCR和RNA-seq技術(shù)檢測(cè)了包括DU145（AR陰性）、C4-2B（AR陽(yáng)性去勢(shì)抵抗）、LN95（神經(jīng)內(nèi)分泌型）在內(nèi)的6種前列腺癌細(xì)胞系，以及LuCaP系列患者來(lái)源異種移植（PDX）模型，覆蓋腺癌、雙陰性前列腺癌（DNPC）和神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌（NEPC）等所有晚期亞型。
2.基因功能調(diào)控平臺(tái)
為實(shí)現(xiàn)FZD6的可逆性調(diào)控，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Tet-On可誘導(dǎo)shRNA系統(tǒng)（pLKO-Tet-On），通過慢病毒感染實(shí)現(xiàn)多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)的FZD6敲低。為驗(yàn)證特異性，還設(shè)計(jì)了shRNA抗性突變體（引入同義突變）進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。選用人激酶sgRNA文庫(kù)（涵蓋763個(gè)激酶的3052條獨(dú)立sgRNA），以MOI=0.3的低感染復(fù)數(shù)確保單基因敲除，通過MAGeCK算法進(jìn)行穩(wěn)健秩聚合（RRA）分析，精準(zhǔn)識(shí)別協(xié)同致死基因（圖5E）。此類篩選服務(wù)，海星生物HySigen亦可提供高質(zhì)量的技術(shù)支持。
3.DNA修復(fù)功能檢測(cè)組合
研究創(chuàng)新性地聯(lián)用三種互補(bǔ)技術(shù)評(píng)估DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)能力：①免疫熒光動(dòng)態(tài)追蹤γH2AX焦點(diǎn)在依托泊苷處理后的清除動(dòng)力學(xué)；②穩(wěn)定整合DR-GFP和EJ5-GFP報(bào)告基因系統(tǒng)，分別定量同源重組修復(fù)（HR）和非同源末端連接（NHEJ）效率；③Western blot檢測(cè)WEE1、ATM、XRCC1等修復(fù)蛋白表達(dá)變化。這種多參數(shù)評(píng)估體系確保了結(jié)論的可靠性。
4.?信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)解析技術(shù)
采用反向蛋白芯片（RPPA）技術(shù)，用466種抗體進(jìn)行全磷酸化蛋白質(zhì)組掃描，快速鎖定SRC、p-STAT3、p-AKT等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。結(jié)合Western?blot、免疫共沉淀（Co-IP）和細(xì)胞組分分離技術(shù)，闡明FZD6-PLK1-WEE1軸的調(diào)控關(guān)系。蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)通過環(huán)己酰亞胺（CHX）追蹤和蛋白酶體抑制劑MG132干預(yù)，揭示W(wǎng)EE1的翻譯后調(diào)控機(jī)制。
5.治療響應(yīng)評(píng)估模型
在體外采用MTT和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖抑制，通過IC50曲線評(píng)估藥物敏感性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用NOD/SCID小鼠建立LuCaP35CR（CRPC模型）和LuCaP176（DNPC模型）皮下移植瘤，采用DOX飲水給藥實(shí)現(xiàn)FZD6誘導(dǎo)性敲低，聯(lián)合順鉑（2.5mg/kg每3天）或PKMYT1抑制劑Lumesertib進(jìn)行治療，以腫瘤體積和生存期作為主要終點(diǎn)指標(biāo)。
二、核心研究結(jié)果?
結(jié)果1：FZD6在晚期前列腺癌中高表達(dá)且高頻擴(kuò)增
FZD6表達(dá)特征：在前列腺癌細(xì)胞系和PDX模型中，F(xiàn)ZD6是表達(dá)量最高的Wnt受體之一，且在CRPC、DNPC、NEPC等多種晚期亞型中穩(wěn)定表達(dá)（圖1A、B）。
基因組變異特征：SU2C/PCF前列腺癌數(shù)據(jù)集顯示，F(xiàn)ZD6是所有FZD家族成員中擴(kuò)增頻率最高的基因（22%），顯著高于其他FZD受體（圖1C）。
臨床相關(guān)性：FZD6表達(dá)水平與前列腺癌Gleason評(píng)分正相關(guān)，高表達(dá)與晚期前列腺癌不良臨床結(jié)局顯著關(guān)聯(lián)（圖1D-F）。
圖1.FZD6在人類前列腺癌中高度表達(dá)和擴(kuò)增，其表達(dá)與前列腺癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)
結(jié)果2：FZD6敲低抑制前列腺癌體外及體內(nèi)生長(zhǎng)
體外增殖抑制：在DU145（AR陰性）、C4-2B（AR陽(yáng)性去勢(shì)抵抗）、LN95（NEPC樣）三種前列腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)ZD6敲低可抑制18.4%-34.3%的細(xì)胞生長(zhǎng)，且回補(bǔ)shRNA抗性FZD6可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，證實(shí)特異性（圖2A-D）。
增殖機(jī)制：FZD6敲低通過降低EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（抑制增殖）發(fā)揮作用，對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響（圖2E）。
體內(nèi)療效驗(yàn)證：在LuCaP35CR（CRPC）和LuCaP176（DNPC）PDX模型中，F(xiàn)ZD6敲低分別抑制50.4%和56.3%的腫瘤生長(zhǎng)，且腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)（BrdU陽(yáng)性率）顯著降低（圖2F-I）。
圖2.FZD6敲低抑制前列腺癌生長(zhǎng)
結(jié)果3：FZD6敲低損傷DNA雙鏈斷裂修復(fù)功能
基因表達(dá)特征：RNA-seq顯示，F(xiàn)ZD6敲低后，“DNA修復(fù)”“雙鏈斷裂修復(fù)”相關(guān)基因本體（GO）條目顯著富集，DNA修復(fù)關(guān)鍵基因（POLE、ENDOV等）表達(dá)下調(diào)（圖3A-C）。
DNA損傷累積：依托泊苷處理后，F(xiàn)ZD6敲低的DU145和C4-2細(xì)胞中，γH2AX焦點(diǎn)（DSB標(biāo)志物）清除延遲，平均焦點(diǎn)數(shù)分別增加2.4倍和3.4倍（圖3D、E）。
修復(fù)通路抑制：DR-GFP和EJ5-GFP報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)，F(xiàn)ZD6敲低可分別抑制38.8%的同源重組（HR）和42.9%的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)活性（圖3F）。
圖3.FZD6敲低損害DNA損傷修復(fù)
結(jié)果4：FZD6通過SRC/STAT3和WEE1-PLK1通路調(diào)控腫瘤進(jìn)展
下游信號(hào)通路鑒定：反向蛋白質(zhì)陣列（RPPA）顯示，F(xiàn)ZD6敲低導(dǎo)致SRC、AKT1、STAT3活性降低，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白WEE1、ATM等表達(dá)下調(diào)（圖4A）；Western blot驗(yàn)證該結(jié)果在多種前列腺癌細(xì)胞及PDX模型中均成立（圖4B、C）。
增殖調(diào)控機(jī)制：過表達(dá)激活型SRC或STAT3可逆轉(zhuǎn)FZD6敲低介導(dǎo)的增殖抑制，證實(shí)SRC/STAT3是FZD6調(diào)控增殖的關(guān)鍵下游通路（圖4D）。
DNA修復(fù)調(diào)控機(jī)制：FZD6敲低通過蛋白酶體途徑加速WEE1降解，過表達(dá)WEE1可逆轉(zhuǎn)γH2AX焦點(diǎn)累積及HR/NHEJ修復(fù)缺陷（圖4E-G）；PLK1敲低可阻斷FZD6缺失誘導(dǎo)的WEE1下調(diào)，證實(shí)PLK1介導(dǎo)WEE1降解（圖4I）。
圖4.FZD6敲低通過WEE1減弱DNA損傷修復(fù)
結(jié)果5：FZD6敲低增強(qiáng)前列腺癌對(duì)化療藥及PKMYT1抑制劑的敏感性
與順鉑協(xié)同增效：在LuCaP35CR PDX模型中，F(xiàn)ZD6敲低聯(lián)合順鉑治療，腫瘤體積較單獨(dú)治療組顯著縮?。?01.6 mm3vs 578.3 mm3/579.9 mm3），且顯著延長(zhǎng)小鼠生存期（圖5A-C）；正常前列腺細(xì)胞RWPE對(duì)順鉑無(wú)協(xié)同敏感性，提示治療安全性（補(bǔ)充圖3B）。
WEE1抑制劑敏感性：FZD6敲低的DU145細(xì)胞對(duì)WEE1抑制劑AZD1775敏感性提升2倍（圖5D）。
CRISPR文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)PKMYT1協(xié)同靶點(diǎn)：激酶CRISPR文庫(kù)篩選顯示，PKMYT1（WEE激酶家族成員）是FZD6敲低后細(xì)胞依賴性最強(qiáng)的激酶基因（圖5F）；FZD6敲低細(xì)胞對(duì)PKMYT1抑制劑Lumesertib的敏感性提升11倍，證實(shí)兩者協(xié)同效應(yīng)（圖5G）。
圖5.FZD6敲低能使前列腺癌對(duì)順鉑和Lumesertib敏感
補(bǔ)充圖3B.在不同濃度順鉑存在的情況下，表達(dá)無(wú)義序列和FZD6 shRNA的RWPE細(xì)胞的生存曲線通過MTT法測(cè)定
三、研究意義
本研究系統(tǒng)性地將FZD6確立為晚期前列腺癌的一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)。它通過雙軌機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)展：一是驅(qū)動(dòng)增殖，二是維護(hù)基因組穩(wěn)定。靶向FZD6不僅能直接抑制腫瘤，還能通過削弱DNA修復(fù)能力，使腫瘤對(duì)基因毒性藥物更加敏感。最具轉(zhuǎn)化價(jià)值的是，通過CRISPR文庫(kù)篩選，研究者發(fā)現(xiàn)了與FZD6構(gòu)成合成致死關(guān)系的激酶PKMYT1。鑒于PKMYT1抑制劑Lumesertib已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，本研究為將其與未來(lái)的FZD6靶向療法聯(lián)合應(yīng)用，提供了令人信服的臨床前證據(jù)。
海星生物可提供專為激酶功能研究設(shè)計(jì)的人激酶CRISPR?敲除文庫(kù)，適用于人激酶的敲除和篩選。該文庫(kù)靶向?763?個(gè)人激酶基因，包含?3052?個(gè)敲除載體，搭配?100?個(gè)對(duì)照載體，保障篩選可靠性。采用lentiGuide-Puro?骨架與輔助質(zhì)粒?lentiCas9-Hygro?的雙載體系統(tǒng)，gRNA?和?Cas9?基因分別位于兩個(gè)載體上，建議先構(gòu)建?Cas9?穩(wěn)轉(zhuǎn)株再轉(zhuǎn)染?gRNA?文庫(kù)，能顯著提升敲除效率與實(shí)驗(yàn)效果，為腫瘤靶點(diǎn)挖掘、協(xié)同治療篩選等研究提供高效工具支持。
參考文獻(xiàn)：Li Y, Zhou Z, Zhang Y, et al. Targeting FZD6 creates therapeutically actionable vulnerabilities for advanced prostate cancer[J]. Oncogene, 2025: 1-10.
