An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment
一種由獨(dú)特的腫瘤免疫微環(huán)境定義的獨(dú)立貧血亞型乳腺癌
發(fā)表期刊：Nat Commun
發(fā)表日期：2019 Dec 3
影響因子：12.121
DOI:??10.1038/s41467-019-13329-5
一、研究背景
腫瘤微環(huán)境影響癌癥的起始和進(jìn)展。在乳腺癌中，臨床病理特征，如年齡，等級，階段和分子亞型與預(yù)后有關(guān)，并驅(qū)動(dòng)治療決策。5種臨床相關(guān)的分子亞型：Luminal A、Luminal B、Her2富集型、基底樣型和正常樣型，其發(fā)病率、生存率、預(yù)后和腫瘤生物學(xué)特性各不相同。
除了癌細(xì)胞生物學(xué)因素外，炎癥微環(huán)境也影響著腫瘤的起始和進(jìn)展。癌細(xì)胞周圍的免疫微環(huán)境可以識(shí)別和抑制腫瘤生長或促進(jìn)進(jìn)展。在乳腺癌中，高免疫浸潤已與更好的臨床結(jié)果。此外，高免疫浸潤已與新輔助和輔助化療的反應(yīng)增加相關(guān)。
二、材料與方法
?1?數(shù)據(jù)來源
1）基因表達(dá)：手術(shù)收集的MicMa隊(duì)列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96，F(xiàn)FPE），MicMa-Agilent（n=104，新鮮冷凍組織））
2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0隊(duì)列（GSE135298，原始數(shù)據(jù)在EGAS00001003631）
3）公開的數(shù)據(jù)：表達(dá)數(shù)據(jù)從GEO、European Genome-phenome Archive、ArrayExpress或TCGA獲得；METABRIC隊(duì)列
?2?分析流程
1）基因集富集分析
2）無監(jiān)督聚類獲得免疫簇：基于509個(gè)基因，使用R包pheatmap對患者的相關(guān)性矩陣進(jìn)行層次聚類
3）Nanodissect：用于淋巴和髓細(xì)胞浸潤的預(yù)測，淋巴細(xì)胞或骨髓細(xì)胞浸潤的nanodissect分?jǐn)?shù)反映了樣本中各自基因的平均表達(dá)量
4）CIBERSORT（22種類型的浸潤性免疫細(xì)胞的絕對比例）、ssGSEA（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞、增殖和細(xì)胞周期相關(guān)途徑的基因集）
5）二項(xiàng)式邏輯回歸預(yù)測免疫集群：R包glmnet （構(gòu)建模型公式）
6）免疫浸潤的病理評估
7）ROR評分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched???0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中，基底、Her2富集、管腔A和管腔B是每個(gè)樣本與R中使用genefu軟件包獲得的質(zhì)心的相關(guān)性
8）統(tǒng)計(jì)學(xué)、生存分析、多變量Cox回歸分析
三、結(jié)果展示
01 -?乳腺癌的免疫簇并反映了逐漸的免疫浸潤
測量了MicMa隊(duì)列的95個(gè)腫瘤樣本中760個(gè)基因的表達(dá)，該陣列旨在剖析實(shí)體腫瘤中的免疫浸潤。這95個(gè)樣本中的79個(gè)樣本之前已經(jīng)通過Agilent全基因組4×44K寡核陣列進(jìn)行了剖析。首先使用Pearson和Spearman相關(guān)性比較了兩個(gè)平臺(tái)獲得的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)值之間存在高度的正相關(guān)（補(bǔ)充圖1A）。
為了根據(jù)免疫相關(guān)基因表達(dá)的相似性對患者進(jìn)行分組，對相關(guān)矩陣進(jìn)行了無監(jiān)督的分層聚類（圖1a和補(bǔ)充圖1B）。從3到10個(gè)聚類的輪廓圖分析表明，3個(gè)聚類最好地捕獲了nCounter和Agilent數(shù)據(jù)集的分割（補(bǔ)充圖1C，D）。比較了兩個(gè)數(shù)據(jù)集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚類結(jié)果。在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，有79個(gè)樣本是重疊的。隨著用于測量基因表達(dá)的不同平臺(tái)，以及基因列表和用于執(zhí)行無監(jiān)督聚類的樣本的不完全重疊，仍然發(fā)現(xiàn)79個(gè)重疊樣本的聚類分配顯著相似。
為了確認(rèn)集群與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)（圖1b），使用算法Nanodissect為總淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞浸潤打分。Nanodissect評分首先在MicMa隊(duì)列中使用有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家分析的匹配蘇木精和曙紅切片的免疫浸潤評估進(jìn)行驗(yàn)證（圖1c和補(bǔ)充圖1E）。發(fā)現(xiàn)這三個(gè)簇與Nanodissect淋巴細(xì)胞（圖1b）和骨髓細(xì)胞（補(bǔ)充圖1F）評分顯著相關(guān)。得出結(jié)論，簇A-C反映了逐漸的免疫浸潤，因此被稱為免疫簇。
使用其他9個(gè)隊(duì)列的表達(dá)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這些簇與淋巴/髓細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)。有509個(gè)基因在所有研究的數(shù)據(jù)集中被發(fā)現(xiàn)，被用于無監(jiān)督聚類（圖1d和補(bǔ)充圖2A，分別用于METABRIC和TCGA隊(duì)列的聚類）。在每個(gè)隊(duì)列中，所得到的三個(gè)聚類與淋巴和骨髓Nanodissect評分顯著相關(guān)（圖1e；補(bǔ)充圖2B）。淋巴和髓細(xì)胞浸潤從簇A（藍(lán)色；低浸潤；冷腫瘤）逐漸增加到簇B（淺藍(lán)色；中等浸潤）和簇C（粉紅色；高浸潤；熱腫瘤）。
對于額外的一層驗(yàn)證，使用METABRIC隊(duì)列中免疫浸潤的病理評估，這與Nanodissect評分（圖1f和補(bǔ)充圖2C）和免疫簇顯著相關(guān)。使用PanCancer免疫剖析陣列的基因進(jìn)行無監(jiān)督分層聚類，可以根據(jù)免疫浸潤的漸進(jìn)水平對乳腺癌腫瘤進(jìn)行分組。
02 -?免疫簇與預(yù)后相關(guān)
對于兩個(gè)最大的隊(duì)列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，發(fā)現(xiàn)簇B(具有中等水平的免疫浸潤)與更差的預(yù)后相關(guān)(補(bǔ)充圖3A，B)。當(dāng)分別對ER陰性（補(bǔ)充圖3C，D）和ER陽性（補(bǔ)充圖3E，F(xiàn)）的病例進(jìn)行分層時(shí)，也觀察到簇B病例的這種更差的結(jié)果。為了完善觀察結(jié)果，根據(jù)簇B（淺藍(lán)色）與簇A和簇C（紫色）繪制了患者生存期圖，并證實(shí)簇B患者的預(yù)后明顯且顯著惡化（圖2）。用相關(guān)生存數(shù)據(jù)在另外四個(gè)隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。結(jié)論是免疫簇與ER陰性和ER陽性乳腺癌的預(yù)后相關(guān)。
03 - 用二項(xiàng)式邏輯回歸預(yù)測免疫簇
基于免疫聚類的臨床相關(guān)性，旨在開發(fā)一種通用的方法，能夠準(zhǔn)確而敏感地預(yù)測患者的預(yù)后較差的分類，而不必依賴于無監(jiān)督聚類。作者使用二項(xiàng)式邏輯回歸，通過lasso進(jìn)行懲罰，得到一組基因，這些基因可以敏感和特異地預(yù)測一個(gè)樣本是否屬于簇B，通過接收者操作特征曲線和曲線下面積（AUC）分析評估（圖3a）。96.3%的樣本被模型預(yù)測為簇A和簇C，而68.8%的樣本分到了簇B（圖3b）。
通過比較生存期對數(shù)秩檢驗(yàn)p值，發(fā)現(xiàn)lasso分類普遍改善了免疫簇與生存期之間的顯著關(guān)聯(lián)。lasso模型在另外5個(gè)隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。圖3c-e為STAM(n = 856)、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)，補(bǔ)充圖5A、B為CAL(n = 118)和PNC(n= 92)。
由于二項(xiàng)式邏輯回歸只預(yù)測了兩個(gè)簇（簇B與簇A和簇C），進(jìn)行了另一輪二項(xiàng)式邏輯回歸，以高準(zhǔn)確度區(qū)分簇A和簇C（補(bǔ)充圖5C，D）。
04 -?免疫簇，一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素
作者進(jìn)一步研究了免疫簇與乳腺癌中著名的臨床病理特征（大小、年齡、等級、階段、淋巴結(jié)受累和分子亞型（PAM50））的關(guān)系。簇A（免疫浸潤度低）富含ER陽性和Luminal病例，而簇C（免疫浸潤度高）中ER陰性和Basal樣病例比例較高，ER陰性和ER陽性樣本以及PAM50亞型在預(yù)后不良的簇B中同樣占有一定比例（圖4a，b）。
使用多變量Cox回歸分析測試了免疫簇的預(yù)后影響，同時(shí)考慮了其他預(yù)后因素。發(fā)現(xiàn)免疫簇是模型生存的重要因素，如每個(gè)隊(duì)列Cox模型中與免疫群相關(guān)的顯著p值所示。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)免疫簇作為重要的預(yù)后生物標(biāo)志物的優(yōu)勢，采用了逐步回溯選擇的方法。對于所有隊(duì)列，免疫簇被保留在最佳擬合的最小模型中，在11個(gè)隊(duì)列中的9個(gè)隊(duì)列中，免疫簇是一個(gè)顯著的預(yù)后變量。
05 -?具有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（ROR）評分的新RNA-seq數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證
EMIT0，這是OSLO2隊(duì)列研究的一個(gè)子集，OSLO2-EMIT0由食品和藥物管理局批準(zhǔn)的Prosigna復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（ROR）分?jǐn)?shù)評估，ROR評分在標(biāo)準(zhǔn)的臨床病理特征之上增加了重要的預(yù)后信息。發(fā)現(xiàn)簇B組成的樣本與簇A和C相比具有中間的ROR評分（圖4c），表明與簇B相關(guān)的不良預(yù)后不可能由ROR評分中包含的信息來解釋。當(dāng)分別評估ER陰性（補(bǔ)充圖7A）和ER陽性（補(bǔ)充圖7B）病例時(shí)有同樣結(jié)果。對于所有隊(duì)列通過已有方法計(jì)算ROR評分，該方法與PAM50亞型有關(guān)，并證實(shí)簇B由中間ROR評分組成（圖4d和補(bǔ)充圖7C，D）。
多變量回歸分析證實(shí)，免疫簇為ROR評分帶來了額外的預(yù)后價(jià)值，這體現(xiàn)在用ROR評分和免疫簇建立生存模型時(shí)，免疫簇的p值顯著。通過計(jì)算凈重分類改善（NRI）和綜合判別改善（IDI）指數(shù)，強(qiáng)調(diào)了免疫簇與ROR評分一起使用時(shí)，根據(jù)生存率對患者進(jìn)行分類的額外價(jià)值，正如所有隊(duì)列中NRI和IDI系數(shù)為正值所示。NRI和IDI的置信區(qū)間（CI）構(gòu)建的Bootstrapping顯示，對于幾個(gè)隊(duì)列，免疫簇與ROR評分相加時(shí)，顯著改善了患者根據(jù)預(yù)后的分類。
06 - 免疫簇和對新輔助化療的反應(yīng)
進(jìn)一步評估了免疫簇與新輔助化療反應(yīng)之間的關(guān)系，使用了來自8項(xiàng)研究（1377個(gè)樣本）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用lasso將每個(gè)樣本分配給其所屬的免疫簇。如圖4e，發(fā)現(xiàn)簇C應(yīng)答者百分比最高，其次是簇A，簇B應(yīng)答者百分比最低。還計(jì)算了每個(gè)組中應(yīng)答者的百分比：簇C平均有42%的應(yīng)答者和58%的殘余疾病患者，而簇B有18%/82%的應(yīng)答者和13%/87%的殘余疾病患者。由于pCR率作為ER狀態(tài)的函數(shù)不同，還獨(dú)立計(jì)算了ER陽性和ER陰性病例的應(yīng)答者比例，發(fā)現(xiàn)無論ER狀態(tài)如何，簇B的應(yīng)答者比例最低（分別為補(bǔ)充圖8A、B）。
對于每個(gè)對新輔助化療有反應(yīng)的隊(duì)列，評估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布。當(dāng)考慮整個(gè)隊(duì)列時(shí)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者在各免疫群組的分布有顯著不同，簇B的應(yīng)答者較少，簇C組的應(yīng)答者居多；當(dāng)按ER狀態(tài)拆分時(shí)，雖然并非總是顯著，但也觀察到同樣的趨勢。這些結(jié)果表明，簇C中的患者有更高的概率成為應(yīng)答者。研究結(jié)果還突出了簇B的低響應(yīng)率，表明這類患者可能是新的新輔助治療方案測試的候選人。
07 - 免疫簇的計(jì)算機(jī)剖析
為了評估集群中的逐漸免疫浸潤是否可以解釋與預(yù)后的關(guān)聯(lián)，在Cox多變量回歸分析中測試了免疫集群或總免疫浸潤評分中哪一個(gè)對生存更有預(yù)測性。作者假設(shè)特定的免疫細(xì)胞類型混合物，而不是腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞總數(shù)，可能是簇B預(yù)后差的原因。
使用CIBERSORT算法估計(jì)22種不同的免疫細(xì)胞類型的比例，對這種細(xì)胞類型特異性中位數(shù)浸潤分?jǐn)?shù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類（圖5a）。簇C病例中，富集了巨噬細(xì)胞M1、記憶激活T細(xì)胞和濾泡T輔助細(xì)胞（圖5a），METABRIC和TCGA隊(duì)列中CIBERSORT評分的分布也說明了這一點(diǎn)（圖5b）。簇A如預(yù)期的那樣，免疫細(xì)胞的水平非常低。在反應(yīng)和預(yù)后較差的簇B中，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M2、靜止肥大細(xì)胞和靜止記憶T細(xì)胞的水平較高（圖5a，圖5b）。
使用廣義線性模型，指定了區(qū)分簇B與簇A-C的免疫細(xì)胞類型（圖5c）。還測試了哪些免疫細(xì)胞類型解釋了簇A與簇B之間的差異和簇B與簇C之間的差異。
08 - 免疫簇的表型分析
通過差異基因表達(dá)分析確定了簇B中顯著過度表達(dá)的基因，與簇A和簇C相比，簇B中有909個(gè)基因分別上調(diào)。這些基因與干細(xì)胞生物學(xué)和EMT相關(guān)，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（圖6a）。
為了進(jìn)一步描述免疫簇與癌細(xì)胞表型之間的關(guān)系，使用了與EMT、干細(xì)胞、缺氧和增殖相關(guān)的基因集。使用GSVA方法計(jì)算了每個(gè)集群和隊(duì)列的平均基因集富集分?jǐn)?shù)，該分?jǐn)?shù)反映了免疫集群中每個(gè)路徑/基因集的活動(dòng)。平均基因集分?jǐn)?shù)的無監(jiān)督聚類將免疫簇A和C分開，而簇B被分為兩個(gè)亞組（圖6b）。這些結(jié)果表明免疫簇與干細(xì)胞/EMT相關(guān)基因特征之間存在關(guān)聯(lián)。
通過GSVA富集分?jǐn)?shù)的無監(jiān)督聚類，確定了乳腺癌中兩個(gè)相互排斥的基因特征：（i）一個(gè)與增殖和胚胎干細(xì)胞樣表型相關(guān)，（ii）另一個(gè)與EMT和乳腺干細(xì)胞表型相關(guān)。增殖表型在簇C中占主導(dǎo)地位（補(bǔ)充圖11A），當(dāng)計(jì)算每個(gè)代謝樣品的基因集得分時(shí)也觀察到了同樣的情況（補(bǔ)充圖11B）。在簇B中，EMT或增殖相關(guān)特征的平均基因集得分較高（補(bǔ)充圖11C）。在代謝物組的樣品水平上，我們觀察到一個(gè)或另一個(gè)狀態(tài)被激活的樣品的類似模式（補(bǔ)充圖11D）。簇A顯示EMT和增殖狀態(tài)得分較低（補(bǔ)充圖11E，F(xiàn)）。
為了正式確定哪些基因集分?jǐn)?shù)解釋簇B，使用廣義線性模型測試每個(gè)基因集的貢獻(xiàn)程度。EMT標(biāo)志對簇B有積極貢獻(xiàn)，而增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性與簇A和C相關(guān)（圖6c）。還測試了當(dāng)單獨(dú)與簇A或簇C比較時(shí)，哪種基因集得分可以解釋簇B。
09?- 腫瘤表型與免疫浸潤的相關(guān)性
由于免疫簇與（i）免疫細(xì)胞類型和（ii）基因集特征相關(guān)，評估了免疫浸潤（CIBERSORT）和癌細(xì)胞特征（基因集分?jǐn)?shù)）之間的關(guān)系。圖6d顯示增殖和EMT分?jǐn)?shù)與不同類型的免疫細(xì)胞顯著相關(guān)。高EMT分?jǐn)?shù)與巨噬細(xì)胞M2、靜息肥大細(xì)胞和靜息記憶T細(xì)胞相關(guān)，而高增殖與更活躍的適應(yīng)性腫瘤微環(huán)境相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明癌細(xì)胞表型和腫瘤微環(huán)境的組成之間存在連續(xù)性。
簇B以致瘤免疫浸潤為主，EMT信號(hào)高，但約35%的簇B也表現(xiàn)為增殖表型。為了探索簇B中的這種異質(zhì)性，以無監(jiān)督的方式根據(jù)基因特征分?jǐn)?shù)將樣本分組為B1以EMT表型為主，B2以增殖為主（圖6e）。
在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的預(yù)后較差（圖6f，g）。為了進(jìn)一步評估基因集評分的異質(zhì)性是否伴隨著免疫環(huán)境的異質(zhì)性，作者尋求B1和B2亞群之間特異性免疫細(xì)胞類型的差異。補(bǔ)充圖14中的無監(jiān)督聚類顯示，兩個(gè)子聚類B1和B2都具有促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境。總而言之，簇B中兩種相互排斥的狀態(tài)可能與預(yù)后有關(guān)；然而，簇B的一個(gè)統(tǒng)一因素是存在促腫瘤/靜息免疫微環(huán)境。
四、結(jié)論
在本研究中，發(fā)現(xiàn)了與臨床相關(guān)的免疫簇與漸進(jìn)性免疫浸潤。在15個(gè)乳腺癌隊(duì)列中，跨越6101個(gè)乳腺癌樣本，腫瘤免疫浸潤中等水平的患者群預(yù)后較差，與已知的預(yù)后分子和臨床病理學(xué)特征無關(guān)。通過對群組免疫成分的表征，發(fā)現(xiàn)親腫瘤免疫浸潤與不良預(yù)后組相關(guān)。進(jìn)一步的表型分析顯示乳腺癌中存在兩種相互排斥的侵襲性腫瘤表型，一種與EMT有關(guān)，另一種與增殖有關(guān)。這兩種表型都是在不活躍/促腫瘤免疫微環(huán)境上發(fā)現(xiàn)的不良預(yù)后群。
