文獻鏈接：Adenoviral-based vaccine promotes neoantigen-specific CD8+ T cell stemness and tumor rejection
發(fā)表期刊：SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
影響因子：19
發(fā)表時間：2022年8月
單細胞轉(zhuǎn)錄組測序用于 臨床前/I期--藥效評估與安全性機制研究
該臨床試驗已經(jīng)推進到I/II期，招募微衛(wèi)星不穩(wěn)定的實體瘤患者：Nous-209 Genetic Vaccine for the Treatment of Microsatellite Unstable Solid Tumors
1. GAd疫苗設(shè)計和新表位穩(wěn)定性驗證
作者選擇了7個預測的免疫原性新表位（來自小鼠MC38結(jié)直腸腺癌細胞系的腫瘤特異性點突變：Cpne1、Irgq、Aatf、Reps1、Med12、Dpagt1、Adpgk）生成一種針對腫瘤特異性新抗原的Ad疫苗（圖1A）
與相應的野生型肽相比，這些肽對主要組織相容性復合體I類（MHC-I）具有最高的結(jié)合親和力，穩(wěn)定性測試顯示：Reps1的穩(wěn)定性最高，其次是Cpne1和Adpgk（圖1 B-D）
2. 小鼠模型評估評估GAd疫苗和PD-1聯(lián)合使用有效性
試驗設(shè)計1：設(shè)置3組注射MC38結(jié)腸腺癌細胞系的C57BL/6J雌性小鼠（G1-G3），從第11天開始G2和G3組小鼠每3天注射一次單克隆抗體PD-1（第11天腫瘤大小在70-100立方毫米），G3組同時在第11天注射多種新抗原GAd疫苗，在腫瘤植入第26天，通過流式細胞術(shù)分析引流淋巴結(jié)、腫瘤和脾臟中的Adpgk+和Reps1+的CD8+ T細胞（圖2A）
2.1 GAd治療擴大腫瘤中的新抗原特異性CD8+ T細胞
兩個新表位（Adpgk和Reps1），在穩(wěn)定性、預測的結(jié)合親和力和體內(nèi)免疫原性方面具有非常相似的特征，具有不同的浸潤腫瘤的能力：
- 生存率分析：與PD-1單藥治療相比，接受GAd和αPD-1聯(lián)合治療的小鼠的抗腫瘤控制增強，總生存率增加（圖2B）
- Reps1+ T細胞：Reps1是一種在腫瘤排斥反應中效率較低的新表位，在未治療的對照組荷瘤小鼠中，Db -Reps1+ CD8+ T細胞的頻率非常低（圖2 C），但僅在脾臟中Db -Reps1+ CD8+ T細胞的頻率和數(shù)量均顯著增強（圖2I），引流淋巴結(jié)和腫瘤組織中沒有顯著差異（圖2 E,G）
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Adpgk+ T細胞：Adpgk是之前研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織浸潤T細胞擴增較明顯的表位，GAd +αPD-1處理的荷瘤小鼠引流淋巴結(jié)、腫瘤和脾臟中Db -Adpgk+ CD8+ T細胞的頻率增加（圖2 D,F,H），同時在GAd免疫聯(lián)合αPD-1抗體治療的小鼠與單獨接受αPD-1治療的小鼠相比，腫瘤和脾臟中Db -Adpgk+ CD8+ T細胞的數(shù)量分別為單獨治療的100倍和10倍。
圖2. GAd疫苗聯(lián)合PD-1治療通過增加小鼠腫瘤新抗原反應性CD8+ T細胞的數(shù)量來控制腫瘤生長；圖A. 試驗設(shè)計；圖B. G1-G3中荷瘤小鼠的總生存率；圖C. G1-G3中荷瘤小鼠的腫瘤新抗原特異性T細胞的流式分析圖；圖D-I. Adpgk和Reps1陽性CD8+ T細胞在引流淋巴結(jié)、腫瘤和脾臟中的百分比
2.2 GAd治療增加了新表位特異性記憶前體和效應體的頻率（流式分析）
GAd免疫聯(lián)合αPD-1免疫后，在荷瘤小鼠中，新抗原特異性CD8+ T細胞的免疫原性增強，分化和擴增的途徑不同。引流淋巴結(jié)和脾臟中有更多的記憶前體細胞，腫瘤中有效應T細胞：
CD127+ KLRG1?：記憶前體
CD127+ CD62L+ KLRG1?：中央記憶
CD127?KLRG1+：短暫效應
CD103+ CD69+ ：組織常駐記憶
PD-1+ CD38+ ：耗竭特性
- 記憶前體T細胞：在引流淋巴結(jié)、腫瘤和脾臟中，用GAd處理的荷瘤小鼠中，檢測到CD127+KLRG1?記憶前體數(shù)量的增加（圖3 A-D；綠色標記）
- 效應T細胞：CD127?KLRG1+Db-Adpgk-特異性CD8+ T細胞（效應體）也發(fā)現(xiàn)在引流淋巴結(jié)、腫瘤和脾臟顯著增加，尤其在腫瘤和脾臟組織中，是αPD-1單藥治療的10倍（圖3 A-D；藍色標記）
耗竭T細胞：腫瘤組織中的記憶前體T細胞進一步分析“耗竭特性”，發(fā)現(xiàn)GAd處理的荷瘤小鼠中PD-1和CD38雙陽性細胞的頻率和數(shù)量增加（圖3 E），而引流淋巴結(jié)中的頻率和數(shù)量較低（圖3 E至H），尤其在下游淋巴結(jié)中低于αPD-1治療組（圖3F）；在腫瘤組織Db-Adpgk+CD127?KLRG1+和CD127?KLRG1?CD8+的T細胞亞群（圖3I)，GAd處理組大約58%和70%的細胞同時表達PD-1和CD38，但僅在CD127?KLRG1?CD8+ 亞群中檢出耗竭T細胞相對其他組顯著增加（圖3K）
組織常駐記憶T細胞：CD103+ CD69+ TRM CD8+ T細胞的頻率在GAd處理組顯著增加（圖3 L,M）
3. 小鼠模型--單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析匯總（scRNA-seq）
試驗設(shè)計2：3組小鼠（G1-G3）植入MC38腫瘤后第17天開始，G2和G3分別接受不同的藥物處理，并在第27天收集3組小鼠淋巴結(jié)和腫瘤組織，流式分選得到的CD8+Adpgk+細胞用于Smart-seq2測序；未作處理的小鼠作為對照標記為CTRL
單細胞測序質(zhì)控分析： CTRL組（9個重復）-157 cells；αPD-1組（5個重復）- 226cells；αPD-1+GAd組（8個重復）- 749cells，UMAP分出7個亞群（圖4B,C），每個亞群的marker表達如圖4E-G
3.1 GAd治療增加了新表位特異性干細胞樣和效應細胞積累（細胞組成分析）
聯(lián)合治療αPD-1+GAd促進了Db -Adpgk+ CD8+ T細胞在淋巴結(jié)中分化為TSTEM前體和腫瘤中的效應亞群（圖4H,I）：
- 聯(lián)合GAd處理組：淋巴結(jié)顯著富集干細胞樣祖細胞（cluster5-69%）；腫瘤組織顯著富集耗竭T細胞（cluster4-44%）和效應T細胞（cluster3- 19%）
- αPD-1處理組：淋巴結(jié)顯著富集早期激活T細胞（cluster6-64%）
- 未治療組：淋巴結(jié)顯著富集幼稚T細胞（cluster2-55%）
3.2 GAd治療改變T細胞分化軌跡并誘導CD8+干細胞樣前體生成（擬時序分析）
- 不同cluster特性分析： 幼稚T細胞cluster2 中TCF7+干細胞樣前體標簽基因顯著富集（記憶性，耗竭性，效應性功能反之）；效應T細胞cluster3 中效應與記憶特征標簽基因顯著富集（耗竭性反之）；耗竭T細胞cluster4 中顯著富集耗竭標簽基因；干細胞樣前體T細胞cluster5 顯著富集記憶性和效應性標簽基因；早期激活T細胞cluster6 表現(xiàn)出衰竭、記憶和效應特征的負富集；在記憶T細胞cluster7 TCF7+腫瘤浸潤、T細胞干性前體、循環(huán)記憶T細胞標簽相關(guān)基因顯著富集，而效應性標簽負富集（圖5 A,B）
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GAd聯(lián)合治療驅(qū)動T細胞向干細胞樣前體，記憶型，效應型T細胞軌跡分化：通過監(jiān)督軌跡分析出3個以幼稚T細胞cluster2為起始的不同分化軌跡（圖5 C），不同處理組在3條軌跡中的占比如圖5D，每條軌跡的marker表達如圖5E，GAd處理小鼠的Db -Adpgk+ CD8+ T細胞在軌跡2和軌跡3占比最高
-- 軌跡1（360 cells）：幼稚T細胞-->激活T細胞
-- 軌跡2（548 cells）：早期活性T細胞-->效應T細胞-->耗竭T細胞，伴隨效應和免疫檢查點抑制相關(guān)基因高表達
-- 軌跡3（561 cells）：記憶T細胞-->干細胞樣前體T細胞-->耗竭T細胞（記憶性和轉(zhuǎn)錄性marker瞬間高表達，免疫檢查點和效應性marker表達增加緩慢）
3.3 GAd聯(lián)合治療可誘導更廣泛的多功能CD8+ T克隆型（TCR-analysis）
總計檢出330個 unique clone 和 34個 擴增型 clone：
- 擴增型clone占比沿分化軌跡增加：幼稚T細胞-->早期激活T細胞-->效應T細胞-->耗竭T細胞（不同cluster中的克隆多樣性分布如圖6B）
- 不同處理組的TCR模式顯著不同： GAd疫苗處理小鼠的擴增型Db -Adpgk+ CD8+ T細胞克隆的數(shù)量最高（如圖6C）
- 不同處理組的淋巴結(jié)和腫瘤TCR對比模式不同：αPD-1處理組中腫瘤和淋巴結(jié)共享克隆型比例高達86%，GAd聯(lián)合處理組共享比例65%（如圖6D,E），兩種組織中高頻率拷貝的共享TCR克隆型映射如圖6F
- 多拷貝克隆型在不同處理組分布存在差異：αPD-1處理組小鼠中發(fā)現(xiàn)多拷貝TCR克隆主要富集在早期激活T細胞、耗竭型T細胞和干細胞樣T細胞前體中；GAd聯(lián)合治療組則主要富集在干細胞樣T細胞前體、效應T細胞和耗竭型T細胞；聯(lián)合治療使得效應T細胞群體（cluster3）TCR庫顯著擴大（圖6G）
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GAd聯(lián)合治療組不同cluster的TCR多樣性差異： 在GAd聯(lián)合治療組中，干細胞樣T細胞前體（cluster 5）的TCR克隆頻率與其他cluster存在顯著差異（這與圖5C中GAd聯(lián)合治療組顯著在軌跡2和軌跡3富集的數(shù)據(jù)吻合）
圖6. 小鼠淋巴結(jié)和腫瘤中記憶型干細胞樣祖細胞和耗竭細胞中TCR克隆型分析；圖G. 多拷貝TCR在各cluster中的分布頻率圖：3個不同的panel表示不同分組，橫軸表示不同cluster，縱軸表示對應TCR類別編號及拷貝數(shù)，顏色表示橫軸所對應TCR在不同cluster中的比例（顏色越深；比例越高）；圖H. αPD-1+GAd處理組小鼠的TCR細胞頻率在各cluster中的分布
4. 臨床I期實驗分析
試驗設(shè)計3：加入臨床試驗的患者首先接種GAd疫苗，隨后通過3次MVA疫苗增強（兩者都編碼209個移碼肽），整個過程中每3周接受一次αPD-1治療，在特定時間點采集外周血（PBMC）7次通過體外酶聯(lián)免疫吸附點（ELISpot）方法分析其對覆蓋所有209 FSPs編碼蛋白的16種肽pool的免疫原性，并針對不同的肽池分析患者的反應廣度，采集穿刺樣本2次進行RNA-seq。（詳細參考圖7A）
參與測試患者12人： dose1（3人）；dose2（9人）
臨床反應： dose1隊列的3例患者表現(xiàn)為部分緩解（PR）；dose2隊列的4例患者表現(xiàn)為部分緩解（PR）；2例患者病情穩(wěn)定（SD）；3例患者表現(xiàn)為階段性進展（PD）；以上均未發(fā)現(xiàn)劑量毒性（圖7B）
4.1 Nous209聯(lián)合治療獲得持久的新表位特異性T細胞應答
- 疫苗免疫原性陽性率測試： dose1隊列的陽性率為67%，dose2隊列陽性率100%（圖7C），相對基線接種前免疫原性顯著提高（圖7D）
- 免疫原性廣度分析：Pt3和Pt6分別為兩種劑量隊列的成員，患者對不同肽的免疫反應如圖7E,F，能夠看到疫苗誘導產(chǎn)生大量IFN-γ+ FSP-specific CD8+ T cells（圖7G）
4.2 Nous-209疫苗誘導dMMR腫瘤患者新抗原特異性TCR克隆型擴大和多樣化（RNA-seq）
采集穿刺樣本的3位患者（Pt1, Pt11, Pt12）均為臨床表現(xiàn)為PR患者，在Nous-209治療后，TCR-β拷貝數(shù)增加，突出了克隆型的擴增和多樣化（圖8A），效應記憶T細胞的RNA相對豐度增加（圖8B）。
驗證疫苗誘導的CD8+ T細胞遷移性（外周血-->腫瘤），選擇Pt1分析（其中引起該患者免疫應答的“突變肽”名為F24，在患者基線期和治療期獲得的腫瘤穿刺樣本都有檢測到對應突變）
- 疫苗接種后的患者外周血經(jīng)IVS試驗可以誘導特異性T細胞擴增：疫苗接種后Pt1血液中F24特異性CD8+T細胞比例增加（圖8D左），外周血經(jīng)過體外刺激（IVS）后，能夠看到F24特異性CD8+T細胞顯著擴增（圖8D右）
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外周血新表位特異性CD8+T細胞能夠成功運輸?shù)侥[瘤部位：在疫苗治療后的腫瘤活檢樣本中檢測到7個F24特異性CD8+T細胞克隆型與IVS試驗(圖8D右)相同的克隆型（圖8E,F）
圖8. Nous-209疫苗接種后，TCR新抗原特異性T細胞克隆庫得到擴大和多樣化；圖A. 3例有臨床反應（PR）患者治療前后腫瘤活檢樣本的TCR-β庫的多樣性比較：橫軸表示TCR clone種類數(shù)，縱軸表示每種TCR的拷貝數(shù)；圖B. RNA-seq數(shù)據(jù)中效應記憶T細胞mRNA比例；圖C. 對患者1（pt1）的研究，患者現(xiàn)狀為臨床IV期-微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高-結(jié)直腸癌-2L in PR，分別在第一次使用PD-1單抗前和治療第八周（56天）取活檢樣本；圖D. Pt1患者的T細胞反應測定：主要測定特異性肽F24，DNSO和CEFX分別為陰性對照和陽性對照，Ex vivo為PBMC無肽孵育的對照組，IVS為PBMC與F24孵育處理組；
