功能基因組學(xué)（Functional genomics）是對(duì)基因組中基因與基因間區(qū)域如何參與不同生物學(xué)過(guò)程的研究。在實(shí)際過(guò)程中，我們經(jīng)常從“全基因組”角度（即包含所有或多個(gè)基因/區(qū)域）出發(fā)，希望將其范圍縮小到要分析的候選基因或區(qū)域列表。
簡(jiǎn)言之，功能基因組學(xué)就是研究基因產(chǎn)物在特定情況下（如特定發(fā)育階段或疾?。┑膭?dòng)態(tài)表達(dá)，并嘗試將開(kāi)發(fā)將我們了解的基因型（功能）與表型聯(lián)系起來(lái)的模型。
根據(jù)憤懣關(guān)注的重點(diǎn)，可以分為以下幾種特定的方法：

• DNA水平（基因組學(xué)和表觀基因組學(xué)）
• RNA水平（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）
• 蛋白質(zhì)水平（蛋白質(zhì)組學(xué)）
• 代謝物水平（代謝組學(xué)）

功能基因組學(xué)

下面著重學(xué)習(xí)下功能基因組學(xué)常見(jiàn)的分析方法：

1.Microarray

微陣列芯片（Microarray）是DNA探針的集合，探針通常是“噴墨印刷”在載玻片（Agilent）上或原位合成（Affymetrix）的掛衣核苷酸鏈（oligo）。來(lái)自目標(biāo)樣品的標(biāo)記單鏈DNA或反義RNA片段在特定調(diào)節(jié)下與DNA微陣列雜交，隨后檢測(cè)特定探針的雜交量。雜交量與樣品中的核酸片段數(shù)量成正比。
Microarray可分為：?jiǎn)紊碗p色。

單色和雙色芯片

雙色芯片可以在一定程度上抵消偏色效應(yīng)

雙色芯片

技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)

重復(fù)

整理分析流程

芯片分析流程

1.1 特征提?。‵eature extration）

特征提取就是將掃描的到信號(hào)轉(zhuǎn)為gene IDs，樣品名稱和其他可用信息的過(guò)程。

特征提取

原始數(shù)據(jù)文件格式

1.2 質(zhì)量控制（Quality Control）

在Expression Atlas中，使用ArrayQualityMEtricsR包進(jìn)行。只要關(guān)注芯片信號(hào)強(qiáng)度，PCA聚類和密度估計(jì)等信息。

質(zhì)量控制

1.3 標(biāo)準(zhǔn)化（Standardization）

芯片的標(biāo)準(zhǔn)化主要用于控制技術(shù)差異，同時(shí)保留生物學(xué)差異。
標(biāo)準(zhǔn)化的流程是基于：

實(shí)驗(yàn)組中大多數(shù)基因相對(duì)于對(duì)照組不會(huì)差異表達(dá)

常見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法：

• Expression Atlas（Affymetrix）→ oligo::rma()
• Agilent單色芯片: limma::normalizeQuantiles()

1.4 差異分析

差異分析是為了鑒定不同條件下表達(dá)不同的基因，此時(shí)應(yīng)進(jìn)行多次測(cè)試的校正。（因?yàn)閷?duì)少量樣品進(jìn)行數(shù)千次比較時(shí)，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的增加）
常見(jiàn)的是應(yīng)用limm包進(jìn)行差異分析

options(digits = 4) #保留4位下數(shù)
library(limma)
group_list <- c(rep("normal",101), rep("tumor",101))
group_list <- factor(group_list, levels=c("nromal", "tumor")
design <- model.matrix(~factor(group_list)) #分組信息
fit <- lmFit(data,design)
fit <- eBayes(fit)
deg <- topTable(fit,coef = 2,adjust="BH",number = Inf) %>%
  arrange(logFC) %>%
  rownames_to_column("id")

2. RNA-seq

RNA測(cè)序是高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)cDNA分子的應(yīng)用，通過(guò)從RNA反轉(zhuǎn)錄獲得。

RNA-seq流程

2.1 建庫(kù)（library）

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建取決于所用RNA的類型，使用總RNA可以檢測(cè)ncRNA和mRNA，但是可能進(jìn)行相應(yīng)處理（如消耗核糖體RNA）以檢測(cè)低豐度的轉(zhuǎn)錄本。PolyA+ RNA富集適合真核生物的mRNA純化。

配對(duì)末端測(cè)序和比對(duì)

另一個(gè)考慮因素是是否生成保留原始RNA轉(zhuǎn)錄方向的鏈特異性文庫(kù)，這對(duì)于鑒定翻譯或非編碼RNA非常重要。

2.2 測(cè)序（sequencing）

從擴(kuò)增的文庫(kù)中獲得核酸序列，以高通量的方式對(duì)每個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序，從一端（單端測(cè)序）或兩端（成對(duì)端測(cè)序）獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)短讀序列+相關(guān)的質(zhì)量評(píng)分（如FASTQ文件）。這個(gè)通常由核心機(jī)構(gòu)或外部公司完成。

FASTQ文件

2.3 質(zhì)量控制

• 去接頭
• 去除低質(zhì)量reads
• uncalled bases
• 過(guò)濾污染物（不是源生物產(chǎn)生的序列）。重要的是要檢查所有樣本的序列質(zhì)量是否相近，并丟棄異常值。
  常用軟件：
• FastQC：質(zhì)量評(píng)估
• Trimmomatic：去除PCR引物，銜接子序列，修剪得分較低的堿基和低質(zhì)量的N堿基。

2.4 比對(duì)和排序

比對(duì)和排序

2.5 Quantification

用GTF（gene transfer format）作為參照，獲取RPKM/FPKM/HTSea-count文件。

2.5 差異分析

常用DESeq2、edgeR差異分析。

RNA-seq數(shù)據(jù)分析