??造血分化是從造血干細(xì)胞分化為具有不同功能的細(xì)胞過程，在成人中主要發(fā)生在骨髓，最終產(chǎn)生淋巴系細(xì)胞,髓系-粒系，紅系等細(xì)胞類型，是研究干細(xì)胞分化、腫瘤免疫、血液疾病等的良好模型。造血分化過程是一個(gè)復(fù)雜、多階段的，受多種因子調(diào)控的過程，單細(xì)胞多組學(xué)分析有助于解析造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞命運(yùn)異質(zhì)性的順式和反式調(diào)節(jié)機(jī)制。
??論文的通訊作者為斯坦福大學(xué)William J. Greenleaf 教授，他的課題組在2013年Nature Methods上發(fā)表第一篇ATAC-seq技術(shù)性文章(Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position)，這個(gè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單，成本低，時(shí)效性快等特征，很快被科學(xué)界所接受，有關(guān)染色質(zhì)開放程度及表觀調(diào)控相關(guān)的研究逐漸流行起來(lái)。
??論文設(shè)計(jì)從健康人捐贈(zèng)的骨髓中分選單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scATAC-seq，經(jīng)過細(xì)胞捕獲，轉(zhuǎn)座酶結(jié)合，PCR擴(kuò)增和測(cè)序，得到造血系統(tǒng)10個(gè)細(xì)胞類型的染色質(zhì)開放圖譜，進(jìn)行了常規(guī)的單細(xì)胞處理分析流程，獲得了2034個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞數(shù)據(jù)，每個(gè)細(xì)胞fragments中位數(shù)為8268，比對(duì)到peaks的比率為76%。值得一提的是之前常規(guī)的motif分析流程，一般首先獲取差異peak，然后用homer等軟件預(yù)測(cè)motif，再結(jié)合TF 數(shù)據(jù)庫(kù)，處理轉(zhuǎn)錄因子footprint等分析；這里使用的greenleaf 實(shí)驗(yàn)室自己開發(fā)的ChromVAR工具，這是專門用于分析chromatin accessibility 的一個(gè)具有多種功能的R包，其中之一就是鑒定不同細(xì)胞的TF motif。
??然后用多種方法對(duì)鑒定出得TF motif聚類，TF Z scores 聚類和TF Z score 與t-SNE結(jié)合聚類的方法都存在缺點(diǎn)：前者不容易鑒定chromatin accessibility 與其他生物變量間的關(guān)系，如細(xì)胞周期，細(xì)胞間的信號(hào)依賴；后者對(duì)細(xì)胞間距離難以解釋；因此文章中又采用了新的算法-reference guided approach，即基于bulk sample 的chromatin accessibility 和相關(guān)的調(diào)控元件。首先對(duì)bulk ATAC-seq sample進(jìn)行主成分（PC）分析，然后對(duì)PC在單個(gè)細(xì)胞中比例進(jìn)行打分，最后根據(jù)PCs標(biāo)準(zhǔn)化后的分值與其他細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行聚類。這個(gè)方法對(duì)后續(xù)研究具有重要參考意義。
??不知道細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，利用k-medoids clustering對(duì)PC分析中的前5種主要成分聚類。研究分析鑒定出14個(gè)亞群，其中CMPs細(xì)分為4個(gè)亞群，GMPs分為2個(gè)亞群，表明這類細(xì)胞存在一定的異質(zhì)性。
??具體研究各譜系細(xì)胞分化連續(xù)軌跡，細(xì)胞層面揭示了血細(xì)胞分化過程。
??對(duì)HSC,CMP,GMP進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，同時(shí)使用他人關(guān)于monocyte scRNA-seq數(shù)據(jù)，基于 reference-guided 方法 配對(duì) scATAC-seq 和 scRNAseq profiles 。根據(jù)這種方法，他們將髓系分化基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)映射到染色質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，并且發(fā)現(xiàn)了已知的髓系分化調(diào)節(jié)因子的預(yù)期表達(dá)模式。還將TF的表達(dá)與TF motif對(duì)比。這種方法對(duì)于多組學(xué)整合分析也提供了思路，既具有借鑒意義。
??共發(fā)現(xiàn)了14,005個(gè)順式調(diào)控元件，這些調(diào)控元件隨著染色質(zhì)開放狀態(tài)的變化也呈現(xiàn)顯著的異質(zhì)性，研究遠(yuǎn)端調(diào)控元件（增強(qiáng)子）與基因表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)合染色質(zhì)構(gòu)想捕獲技術(shù)HiC證實(shí)形式環(huán)可以促進(jìn)調(diào)控元件與基因的結(jié)合。
??DNA的物理可接近是染色質(zhì)高度動(dòng)態(tài)過程，在建立和維持細(xì)胞特征方面發(fā)揮著重要作用?；蚪M可接近染色質(zhì)的組織形式反映了可能的物理性相互作用網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、絕緣體和染色質(zhì)結(jié)合因子共同作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種可及性情況會(huì)隨著外部刺激和發(fā)育的變化而動(dòng)態(tài)變化。新的證據(jù)表明，可及性的穩(wěn)態(tài)維持本身是通過染色質(zhì)結(jié)合因子和核小體之間的競(jìng)爭(zhēng)相互作用來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的。
??和RNA-seq類似，通過對(duì)單分子和單細(xì)胞可及性的檢測(cè)表明，對(duì)細(xì)胞群體的可及性檢測(cè)代表不同分子狀態(tài)的整體平均值。當(dāng)觀察一個(gè)潛在的、動(dòng)態(tài)的、不同步的過程時(shí)，這種分子異質(zhì)性自然會(huì)出現(xiàn)。例如，在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，RNA聚合酶及其他TF一起，置換TSS上游的核小體，并移動(dòng)啟動(dòng)子下游位置良好但不穩(wěn)定的核小體。對(duì)單分子NOMe-seq數(shù)據(jù)的足跡分析揭示了這一過程，隨著轉(zhuǎn)錄過程的展開，捕捉每個(gè)分子狀態(tài)。盡管會(huì)受采樣效率的影響，但是單細(xì)胞可及性檢測(cè)與對(duì)整個(gè)基因組調(diào)節(jié)區(qū)域的預(yù)測(cè)得到相似的分子異質(zhì)性結(jié)果。
參考材料：
http://greenleaf.stanford.edu/index.html
http://geneskybiotech.com/sup/research/1344.html
http://www.itdecent.cn/p/ae4fe0a4b208
http://www.biodiscover.com/news/research/733290.html
