RNA-seq看表達量高低是看哪個值？
1.Read count
(1)數(shù)值概念：比對到gene A的reads數(shù)。
(2)用途：用于換算CPM、RPKM等后續(xù)其他指標(biāo)；作為基因表達差異分析的輸入數(shù)值。
大部分差異分析軟件（如DESeq和edgeR），用原始的可比對的reads count作為輸入，并用負二項分布模型估算樣本間基因差異表達的概率。
軟件自動會對reads count做一些校正。如果你使用一些校正后的指標(biāo)，例如RPKM作為輸入，是不合理的。
2.CPM：Counts per million
(1)數(shù)值概念：計算公式：CPM=C/N*1000000
設(shè)C為比對到 gene A 的 reads 數(shù)（read count），
N 為比對到所有 gene 的總reads 數(shù)。
(2)用途：在某些情況下,只想了解每個基因被覆蓋到的相對reads數(shù)，而不希望對其做長度校正，就會使用這個指標(biāo)。
在某些RNA-seq文章或一些軟件輸出結(jié)果中（如edgeR）會出現(xiàn)。
CPM只對read count相對總reads數(shù)做了數(shù)量的均一化。
當(dāng)如果想進行表達量的基因間比較，則不得不考慮基因長度的不同。
如果進一步做長度的均一化，就得到了下面的RPKM。
3.RPKM：Reads Per kb perMillion reads
(1)數(shù)值概念：計算公式：RPKM=(1000000C)/(NL/1000)
設(shè)C 為比對到 gene A 的 reads數(shù)（read count），
N為比對到所有 gene 的總 reads 數(shù)，L 為 gene A 的堿基數(shù)。 RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，
計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因表達差異。
(2)用途：用于與基因表達量相關(guān)的后期分析.例如:基因表達趨勢分析,共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，熱圖繪制等都使用這類數(shù)值。
FPKM意義與RPKM極為相近。
二者區(qū)別僅在于，F(xiàn)ragment 與Read。
RPKM的誕生是針對早期的SE測序，F(xiàn)PKM則是在PE測序上對RPKM的校正。
只要明確Reads和Fragments的區(qū)別，RPKM和FPKM的概念便易于區(qū)分。
Reads即是指下機后fastq數(shù)據(jù)中的每一條Reads，
Fragments則是指每一段用于測序的核酸片段。
1.RNA-Seq又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測序(transcriptome sequencing)或稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序(Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS)
把高通量測序技術(shù)應(yīng)用到由 RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 上，
從而獲得來自不同基因的RNA 片段在特定樣本中的含量
2.基因表達（gene expression）
基因組中結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，合成蛋白質(zhì)，
進而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能的全過程。
3.轉(zhuǎn)錄組
遺傳學(xué)中心法則表明,遺傳信息通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質(zhì),
因此,mRNA被稱為DNA和蛋白質(zhì)之間信息傳遞的”橋梁”,
而所有表達基因的序列及其轉(zhuǎn)錄水平,綜合起來被稱為 轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)。
即:特定組織或細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，
包括mRNA和非編碼RNA。
轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）
廣義上指某一生理條件下，細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，
包括信使mRNA、核糖體rRNA、轉(zhuǎn)運tRNA及非編碼non-coding RNA；
狹義上指所有mRNA的集合。
蛋白質(zhì)是行使細胞功能的主要承擔(dān)者，蛋白質(zhì)組是細胞功能和狀態(tài)的最直接描述，
轉(zhuǎn)錄組成為研究基因表達的主要手段，
轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，
轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。
基因的Transcript Variant 和 isoform的區(qū)別如下：
1.transcript variant是從結(jié)果來看的，一個基因產(chǎn)生了不同的mRNA；
splice variant是從過程講的，強調(diào)內(nèi)含子剪切的方式不一樣。
variant指的是轉(zhuǎn)錄本的亞型，
isform指的是蛋白水平的。
有的時候雖然variant很多但是對應(yīng)的蛋白可能是重復(fù)的。
2.有很多過程可以影響isoform的形成，如可變剪切，
即不一定所有的外顯子都用來形成成熟的mRNA,而且有時候什么內(nèi)含子,外顯子也不是絕對的。
另外有RNA editing這個過程，會使得形成mRNA時某個特定的位置的堿基發(fā)生變化，
也就是變成不是原來基因想要編碼的東西。
有個例子就是一個叫XBP-1的轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控細胞的unfolded protein response，
激活方式就是上游蛋白剪切其mRNA然后生成有活性的mRNA，
所以這種variant的生成竟然也是調(diào)控的一種方法。
