Nat Biotech | RNA反應(yīng)元件控制真核轉(zhuǎn)錄:合成生物學(xué)+細(xì)胞工程

原創(chuàng)?圖靈基因?圖靈基因?今天

收錄于話題#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

由Wyss生物靈感工程研究所和麻省理工學(xué)院（MIT）的研究人員領(lǐng)導(dǎo)的一個合成生物學(xué)家和細(xì)胞工程師團(tuán)隊設(shè)計了一種技術(shù)，使在包括人體細(xì)胞在內(nèi)的靶細(xì)胞中選擇性地啟動基因治療成為可能。這些方法利用了被稱為eToeholds的小型多功能裝置，這種裝置內(nèi)置于RNA中，只有在存在細(xì)胞特異性或特定病毒RNA時，才能夠表達(dá)連接的蛋白質(zhì)編碼序列。

這種高度針對性的方法基于病毒用來控制宿主細(xì)胞基因翻譯的基因元件，可能有助于避免某些影響整個身體的治療的副作用。研究人員認(rèn)為，eToehold平臺可以為開發(fā)更具針對性的RNA療法、設(shè)計體外細(xì)胞和組織工程方法以及為感知人類和其他高等生物的各種生物威脅提供多種機(jī)會。例如，在癌癥治療中，可以利用eToehold方法設(shè)計一個識別癌細(xì)胞的系統(tǒng)，然后產(chǎn)生有毒蛋白質(zhì)，但只能在癌細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生。

“這為新興的RNA療法領(lǐng)域帶來了新的控制電路，開辟了下一代RNA療法，這些療法可以設(shè)計為僅以細(xì)胞特異性或組織特異性方式開啟?！甭槭±砉W(xué)院醫(yī)學(xué)工程與科學(xué)研究所（IMES）和生物工程系的醫(yī)學(xué)工程與科學(xué)特聘教授James Collins博士說，“eToeholds不僅可以在人類、植物和其他高等生物中實(shí)現(xiàn)更具體、更安全的RNA治療和診斷方法，還可以作為基礎(chǔ)研究和合成生物學(xué)的工具?！?/p>

Collins是該團(tuán)隊研究的資深作者，該研究發(fā)表在《Nature Biotechnology》上，標(biāo)題為“RNA-responsive elements for eukaryotic translational control”。

在細(xì)胞中，RNA的基本功能是將基因編碼的信息翻譯成蛋白質(zhì)。然而，RNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和相對穩(wěn)定性也讓科學(xué)家們考慮將這種生物材料作為新型療法、合成生物標(biāo)志物和疫苗的基礎(chǔ)，第一批針對SARS-CoV-2的mRNA疫苗的開發(fā)就證明了這一點(diǎn)。

將合成的RNA分子輸送到細(xì)胞中，本質(zhì)上是指導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)，然后可以執(zhí)行治療、診斷和其他功能。研究人員面臨的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是如何確保只有引起或受特定疾病影響的細(xì)胞才能表達(dá)這種蛋白質(zhì)。這種能力可以幫助減少不必要的副作用，這些副作用可能與未受影響的細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。

2014年，Collins的團(tuán)隊與Wyss核心教員Peng Yin博士一起成功開發(fā)了細(xì)菌的立足點(diǎn)開關(guān)，該開關(guān)在關(guān)閉狀態(tài)下表達(dá)，并通過細(xì)菌蛋白質(zhì)合成機(jī)制啟動所需蛋白質(zhì)的合成，對特定觸發(fā)RNA作出反應(yīng)。該系統(tǒng)的工作原理是引入立足點(diǎn)RNA分子，該分子與編碼特定目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA分子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。（核糖體是根據(jù)mRNA指令組裝蛋白質(zhì)的地方。）這種結(jié)合會阻止mRNA轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，因?yàn)樗荒芨街胶颂求w上。

RNA立足點(diǎn)還包含一個序列，該序列可以與作為觸發(fā)器的不同mRNA序列結(jié)合。如果檢測到該目標(biāo)mRNA序列，則腳趾會釋放其抓地力，并將被阻斷的mRNA轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。這種mRNA可以編碼任何基因，如熒光報告分子。這種熒光信號為研究人員提供了一種可視化的方法，以確定是否檢測到了目標(biāo)mRNA序列。

然而，細(xì)菌的立足點(diǎn)設(shè)計不能用于更復(fù)雜的細(xì)胞，包括人類細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)合成裝置更為復(fù)雜。在他們的新研究中，研究人員開始嘗試創(chuàng)建一個類似的系統(tǒng)，可以用于真核細(xì)胞，包括人類細(xì)胞。由于真核細(xì)胞中的基因翻譯更為復(fù)雜，因此它們在細(xì)菌中使用的遺傳成分無法導(dǎo)入人體細(xì)胞。相反，研究人員利用病毒用來劫持真核細(xì)胞的系統(tǒng)來翻譯它們自己的病毒基因。該系統(tǒng)由稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的RNA分子組成，它可以招募核糖體并啟動RNA向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

“這些是病毒為了劫持核糖體而開發(fā)的復(fù)雜RNA折疊，因?yàn)椴《拘枰业侥撤N方式來表達(dá)蛋白質(zhì)?！惫餐谝蛔髡逧van Zhao博士解釋說，他是Collins團(tuán)隊的博士后研究員，與合作第一作者和Wyss技術(shù)開發(fā)研究員Angelo Mao博士合作，結(jié)合各自在合成生物學(xué)和細(xì)胞工程領(lǐng)域的專業(yè)知識。

IRES是在病毒RNA中發(fā)現(xiàn)的有效序列，它允許宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成核糖體進(jìn)入病毒基因組編碼病毒蛋白質(zhì)序列旁邊的一段。一旦與RNA結(jié)合，核糖體開始掃描蛋白質(zhì)編碼序列，同時通過在其生長末端依次添加相應(yīng)的氨基酸來合成蛋白質(zhì)。

研究人員從不同類型的病毒中自然產(chǎn)生的IRES開始，并對其進(jìn)行改造，使其包含一個與觸發(fā)mRNA結(jié)合的序列。當(dāng)工程化的IRES被插入到輸出轉(zhuǎn)基因之前的人類細(xì)胞中時，它會阻止該基因的翻譯，除非在細(xì)胞內(nèi)檢測到觸發(fā)mRNA。觸發(fā)器導(dǎo)致IRES恢復(fù)并允許基因被轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)?！拔覀冮_發(fā)了基于RNA的真核模塊，稱為eToeholds，它能夠通過特定trRNA的存在來調(diào)節(jié)順式報告基因的轉(zhuǎn)化。這些eToeholds包含經(jīng)過修飾的IRES，其設(shè)計為在與特異性trRNAs的正-反義相互作用引起激活之前處于非活性狀態(tài)?！痹搱F(tuán)隊解釋道。

“在這項研究中，我們采用了IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）元素，這是某些病毒中常見的一種控制元素，它利用真核蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制，并將它們從頭開始設(shè)計成多功能設(shè)備，可以通過編程來感知人類、酵母和植物細(xì)胞中的細(xì)胞或病原體特異性觸發(fā)RNA。”研究人員說。

“我們通過引入相互結(jié)合的互補(bǔ)序列來形成抑制性堿基配對結(jié)構(gòu)，阻止核糖體與IRES結(jié)合，從而向前推進(jìn)工程IRES序列?！毖芯咳藛T補(bǔ)充道，“eToeholds中的發(fā)夾環(huán)編碼序列元件的設(shè)計使其與與已知觸發(fā)RNA互補(bǔ)的特定傳感器序列重疊。當(dāng)觸發(fā)RNA存在并與eToeholds中的補(bǔ)體結(jié)合時，發(fā)夾環(huán)斷裂，核糖體可以開始工作并產(chǎn)生蛋白質(zhì)?！?/p>

在快速迭代的過程中，科學(xué)家們能夠設(shè)計和優(yōu)化在人類和酵母細(xì)胞中起作用的eToeholds，以及無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成分析。他們使用該技術(shù)開發(fā)了可以檢測人類和酵母細(xì)胞內(nèi)各種不同觸發(fā)因素的立足點(diǎn)。首先，他們表明他們可以檢測到編碼寨卡病毒和SARS-CoV-2病毒基因的mRNA。研究人員進(jìn)一步指出，這項技術(shù)的一個可能應(yīng)用是設(shè)計在感染期間檢測病毒mRNA并對其作出反應(yīng)的T細(xì)胞?！拔覀冞M(jìn)一步表明，表達(dá)eToeholds的穩(wěn)定細(xì)胞系可用于感知自然病毒感染（寨卡病毒）和病毒轉(zhuǎn)錄物（SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)）。我們還證明了eToeholds通過基于內(nèi)源性RNA水平選擇性激活蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化來區(qū)分不同細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型的能力?！?/p>

他們還設(shè)計了能夠檢測人類細(xì)胞中自然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)mRNA的立足點(diǎn)分子，這有助于揭示細(xì)胞狀態(tài)，如壓力。例如，他們表明他們可以檢測熱休克蛋白的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞暴露在高溫下時會產(chǎn)生熱休克蛋白?！拔覀儼l(fā)現(xiàn)eToeholds可以檢測各種細(xì)胞內(nèi)RNA，包括通過轉(zhuǎn)染或感染引入的RNA，以及內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物，如指示細(xì)胞狀態(tài)或細(xì)胞類型的那些?！毖芯咳藛T說，“如本文所示，當(dāng)存在細(xì)胞類型特異性或細(xì)胞狀態(tài)特異性RNA轉(zhuǎn)錄物時，啟動所需蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力具有相當(dāng)大的治療潛力?！?/p>

研究人員還證明，他們可以通過設(shè)計檢測酪氨酸酶（一種在黑色素瘤細(xì)胞中產(chǎn)生過量黑色素的酶）mRNA的立足點(diǎn)來識別癌細(xì)胞，這種靶向性可以使研究人員開發(fā)出一種療法，當(dāng)在細(xì)胞中檢測到癌蛋白時，會觸發(fā)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而引發(fā)細(xì)胞死亡。

“這個想法是，你將能夠靶向任何獨(dú)特的RNA特征并提供治療方法?！毖芯咳藛T說，“這可能是一種限制生物分子在靶細(xì)胞或組織中表達(dá)的方法。我們設(shè)計了專門檢測寨卡病毒感染和人類細(xì)胞中SARS-CoV-2病毒RNA的eToehold，以及由細(xì)胞特異性RNA觸發(fā)的其他eToehold，例如僅在皮膚黑素細(xì)胞中表達(dá)的RNA。重要的是，eToeholds和與它們相連的編碼所需蛋白質(zhì)的序列可以編碼為更穩(wěn)定的DNA分子，當(dāng)引入細(xì)胞時，這些分子會轉(zhuǎn)化為RNA分子，并根據(jù)我們想要的蛋白質(zhì)表達(dá)類型進(jìn)行定制。這擴(kuò)大了eToehold輸送到靶細(xì)胞的可能性?！?/p>

研究人員認(rèn)為，eToehold平臺有助于將RNA療法和某些基因療法靶向特定的細(xì)胞類型，這一點(diǎn)很重要，因?yàn)樵S多此類療法都受到過度脫靶毒性的阻礙?！霸S多核酸靶向療法的臨床應(yīng)用受到過度脫靶毒性的阻礙。”他們指出，“eToehold模塊翻譯蛋白質(zhì)或基于蛋白質(zhì)的前體以響應(yīng)mRNA信號的能力將有助于通過將所需療法的激活限制在特定靶細(xì)胞上來應(yīng)對這一挑戰(zhàn)?！?/p>

此外，該平臺還可以促進(jìn)體外分化方法，引導(dǎo)干細(xì)胞沿著發(fā)育途徑生成用于細(xì)胞治療和其他應(yīng)用的特定細(xì)胞類型。干細(xì)胞和中間細(xì)胞沿著許多分化細(xì)胞譜系的轉(zhuǎn)化通常不是很有效，而eToeholds可以幫助豐富所需的細(xì)胞類型。