今年四月份發(fā)表在circulation上的一篇LETTER，作者是斯坦福大學(xué)的Joseph C. Wu教授。
心臟移植是終末期心衰患者治療的基石。由于免疫抑制策略的發(fā)展和患者長期合并癥的改善，移植后生存率獲得了巨大提升。 盡管如此，中位移植物存活期仍為12.5 年，原發(fā)性移植物功能障礙是導(dǎo)致死亡的主要原因，占心臟移植人群死亡人數(shù)的 22%。盡管排斥反應(yīng)、同種異體移植心臟血管病變和各種供體特征都與移植心臟的功能障礙有關(guān)，免疫抑制劑如鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑（tacrolimus他克莫司）和增殖信號抑制劑（sirolimus西羅莫司，也就是雷帕霉素）對長期移植物功能的潛在心血管不良影響仍然不明確。
在這個研究中，作者在比較了與每種藥物相關(guān)的臨床表型后，使用人類誘導(dǎo)的多能干細胞衍生的心臟類器官模型檢測了他克莫司和西羅莫司的心血管作用。
A：作者首先通過連續(xù)超聲心動圖檢測評估了移植后 6 至 30 個月左室 (LV) 質(zhì)量的變化來評估心臟移植物的重塑。作者根據(jù)心臟移植時使用的免疫抑制劑Tacrolimus/Sirolimus對患者進行分組。結(jié)果顯示和Tacrolimus組相比，Sirolimus組存在明顯的左室質(zhì)量減低 (reduction of 19.91 g, 95% CI reduction of 25.6 g to 7.85 g)。LV 質(zhì)量增加是不良重塑的一個特征，可能導(dǎo)致舒張功能障礙和心臟移植物功能障礙。這個結(jié)果與此前一項研究觀察到與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑相比，增殖信號抑制劑具有良好的心臟重塑特征相一致1。
B：為了闡明導(dǎo)致 LV 質(zhì)量變化的機制，作者使用了人類心臟類器官。它們是由誘導(dǎo)多能干細胞衍生的心肌細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的組成的球型心臟多細胞簇 (CMC)。 作者使用他克莫司、西羅莫司或載體處理 CMC，并進行功能表型分析。
CMC只包含心肌、內(nèi)皮、成纖維嗎？
C：作者沒有觀察到藥物治療組相比control組出現(xiàn)明顯的細胞死亡和活性氧反應(yīng)（結(jié)果未展示）。結(jié)果還顯示，在藥物治療5d后，CMCs沒有出現(xiàn)明顯的收縮和舒張速度的差異，和臨床上沒有發(fā)現(xiàn)這些藥物可以引起收縮和舒張功能的快速改變相一致。
D：為了進一步探究免疫抑制劑治療下的細胞類型特異性反應(yīng)，以解釋臨床上的生理差異，作者對CMCs進行了單細胞測序。得到了不同治療條件下的心肌、內(nèi)皮、成纖維3類細胞。
E：tacrolimus治療組，CMC中的成纖維細胞展現(xiàn)出高表達膠原產(chǎn)生、細胞黏附、細胞外基質(zhì)形成的基因如SERPINH1, P4HB, PLOD1, COL21A1和P3H4。
F：作者還觀察到，和sirolimus組相比，tacrolimus治療組的心肌細胞和成纖維細胞都高表達BNIP3。既往有研究顯示BNIP3與缺血后模型中心臟促纖維化反應(yīng)和心臟不良重塑有關(guān)。這些結(jié)果顯示tacrolimus可能與細胞外基質(zhì)沉積和adverse remodeling有關(guān)。
而在Sirolimus治療組的心臟成纖維細胞中則沒有觀察到這種現(xiàn)象，而且心肌細胞出現(xiàn)高表達心肌細胞marker如NPPA和TNNI1。在內(nèi)皮細胞中也沒有觀察到上述基因變化。
G：為了驗證檢測到的基因表達變化是否與更促纖維化表型一致，作者檢查了sirolimus和tacrolimus對iPSC衍生的心臟成纖維細胞的影響，發(fā)現(xiàn)與對照組或tacrolimus相比，sirolimus與顯著降低的細胞增殖有關(guān)。此外作者觀察到與sirolimus和對照組或相比，tacrolimus組出現(xiàn)明顯的膠原產(chǎn)生增加。這提示和tacrolimus相比，sirolimus與更少的促膠原形成及促纖維化表型相關(guān)，提示它(至少部分)更少的驅(qū)動了成纖維細胞增殖。
H：劑量滴定實驗提示與前述一致的效應(yīng)在tacrolimus 10 nmol/L和sirolimus 10 nmol/L的低劑量下就可以發(fā)生。
Summary
該研究結(jié)果表明，與tacrolimus相比，sirolimus與 CMC 中較少的纖維化表型相關(guān)。 增加的纖維化和細胞外基質(zhì)沉積是在出現(xiàn)了LV 質(zhì)量增加和心臟移植物功能障礙相關(guān)的多種心肌病的特征。 該結(jié)果表明，不同的心臟成纖維細胞調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致心臟移植物功能障礙的不良重塑特征。 這些發(fā)現(xiàn)可以解釋增殖信號抑制劑（西羅莫司）對本研究和其他相關(guān)研究中觀察到的不良重塑的長期益處。
此外，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑（tacrolimus）可能與心臟組織中的促纖維化表型趨勢相關(guān)，這可能導(dǎo)致不利的心臟重塑。 總之，將iPSC衍生的心臟類器官與單細胞 RNA 測序相結(jié)合，可以為未來的研究提供一個平臺，以發(fā)現(xiàn)更有針對性的方法來改善tacrolimus相關(guān)的心臟重塑并復(fù)制有利的sirolimus心臟特征。
References:
Paoletti E. mTOR inhibition and cardiovascular diseases: cardiac hypertro- phy. Transplantation. 2018;102(2S suppl 1):S41–S43. doi: 10.1097/TP. 0000000000001691
在2014年的時候Joseph C. Wu教授還發(fā)表過這樣一篇CR
1. Expression of Cardiomyocyte Markers and CAR in hiPSC-CMs
Fig 1A：study design
Fig 1B：誘導(dǎo)出來的hiPSC-CMs表達心臟特異性的肌小節(jié)蛋白cTnT和a-Actin。
Fig 1C：hiPSC-CMs的cell–cell junctions有CAR的表達。（Nuclear stain for CAR in CMs has been previously reported and may repre- sent antibody cross-reactivity with a nuclear antigen.）
CAR在hiPSCs中也表達，提示hiPSCs和hiPSC-CMs都可以被CVB3感染（附件）。
Fig 1D：作者使用qpcr檢測了hiPSC向hiPSC-CMs分化15天后的基因表達。15天后，pluripotency gene (POU5F1)出現(xiàn)明顯下調(diào)而心肌特異性marker MYH6出現(xiàn)顯著上調(diào)。CXADR下降了2倍？WHY?
CXADR表達下降，作者的解釋：CXADR expression in hiPSC-CMs is 30-fold less than that of primary adult human left ventricular myocardium sample (Online Figure IV). However, CXADR expression in hiPSC-CMs is 10-fold higher than in HL-1 mouse cardiac cells (Online Figure IV). These results demonstrate that hiPSC-CMs express CAR along with cardiac-specific markers.
？我不是很理解
2. Characterization of hiPSC-CMs Infected With CVB3-Luc
隨后作者使用了hiPSC-CM/CVB3-Luc系統(tǒng)檢測了the efficacy of antiviral compounds in abrogating viral proliferation in vitro。
3. Quantification of CVB3-Luc Proliferation on hiPSC-CMs
4. Antiviral Drug Treatments Abrogate CVB3-Luc Proliferation
7. hiPSC-CMs Provide Mechanistic Insight Into IFNβ1-Induced Viral Clearance Pathways
