摘要：

選擇性剪接(AS)在哺乳動物基因組中普遍存在，但跨物種比較主要局限于成體組織，大多數(shù)AS事件的功能仍不清楚。研究人員評估了六種哺乳動物和一只鳥類的七個器官產(chǎn)前和產(chǎn)后發(fā)育中的AS模式。分析表明，發(fā)育動態(tài)AS事件,特別是在大腦中普遍存在，實(shí)質(zhì)上比非動態(tài)更加保守。在發(fā)育過程中，包含頻率增加的盒式外顯子顯示出最強(qiáng)的保守和調(diào)控AS信號。新近出現(xiàn)的盒式外顯子通常在睪丸發(fā)育的后期被整合，但在進(jìn)化過程中保留的外顯子主要是大腦特異性的。本研究表明，控制基因表達(dá)水平和選擇性剪切的程序之間復(fù)雜相互作用是器官發(fā)育的基礎(chǔ)，特別是對大腦和心臟。在這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，選擇性剪切通過從廣泛表達(dá)的基因中產(chǎn)生組織特異性和時(shí)間特異性的亞型，提供了基因的大量功能多樣化。

前言：

選擇性剪接是在前信使RNA中不同地選擇剪接位點(diǎn)以產(chǎn)生不同的RNA和蛋白質(zhì)異構(gòu)體的過程1。選擇性剪接在哺乳動物中普遍存在，影響大多數(shù)多外顯子基因，并解釋了巨大的異構(gòu)體多樣性。許多可供選擇的剪接網(wǎng)絡(luò)和功能的調(diào)節(jié)方面已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。然而，大多數(shù)可供選擇的異構(gòu)體的功能相關(guān)性仍不清楚2。基因組規(guī)模的研究報(bào)告說，只有一小部分選擇性剪接事件表現(xiàn)出進(jìn)化上的保守性或具有其他廣泛的功能支持3-10。因此，有人認(rèn)為，選擇性剪接產(chǎn)生的大部分異構(gòu)體多樣性代表轉(zhuǎn)錄噪聲4,6-10，盡管這種解釋一直有激烈的爭論8,9,11,12。?

跨物種比較為全面評估選擇性剪接的功能、調(diào)控機(jī)制和進(jìn)化動力學(xué)提供了一個強(qiáng)大的框架；例如，他們揭示了選擇性剪接事件在進(jìn)化過程中的總體快速更替，并確定了祖先哺乳動物的剪接調(diào)控因子和相關(guān)的結(jié)合基序5，13。然而，這項(xiàng)工作僅限于成體組織(除外2，14-17)，盡管選擇性剪接可能在器官發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用2，17。

為了填補(bǔ)這一關(guān)鍵空白，我們基于廣泛的RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)集18，生成了七個物種的七個器官的發(fā)育選擇性剪接圖譜(https://apps.kaessmannlab.org/alternative-splicing)。對這些圖譜的綜合比較分析揭示了哺乳動物器官發(fā)育過程中選擇性剪接的進(jìn)化動力學(xué)和功能相關(guān)性。

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發(fā)育選擇性剪接圖譜。為了研究發(fā)育選擇性剪接的進(jìn)化，我們利用了一個包含1890個文庫的RNA-seq數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)庫涵蓋了從早期器官發(fā)生(心臟的器官中期發(fā)生)到成年的7個器官(前腦/大腦、后腦/小腦、心臟、腎臟、肝臟、卵巢和睪丸)的發(fā)育，涉及6種哺乳動物(人、獼猴、小鼠、大鼠、兔子和負(fù)鼠)和一只鳥(雞)18只(圖1a；我們對所有物種的轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行了詳細(xì)的從頭注釋，包括剪接位點(diǎn)的精確定位(補(bǔ)充數(shù)據(jù)1-7)。這種從頭注釋防止了由于物種之間的基因組注釋質(zhì)量差異而在下游分析中產(chǎn)生的偏差，并檢測到新的剪接變體15、19、20(補(bǔ)充圖1和方法)。我們將基因片段定義為兩個相鄰剪接位點(diǎn)之間的序列(補(bǔ)充圖2)。可選片段(即并不包括在所有轉(zhuǎn)錄本亞型中的片段)被分為四個主要的可供選擇剪接類別：可供選擇的盒外顯子、可供選擇的供體片段、可供選擇的受體片段和內(nèi)含子保留事件(圖1b)。使用已建立的程序15、19、20(方法)測定每個備選片段和物種間1：1同源外顯子的包涵體頻率(剪接百分比(PSI))(補(bǔ)充數(shù)據(jù)8)。

我們從七個物種中確定了數(shù)千個主要編碼可供選擇的剪接事件，用于七個物種的每個器官中的四個類別(圖1b，補(bǔ)充表1和方法)。正如之前觀察到的那樣，盒式磁帶外顯子和內(nèi)含子保留是最常見的兩類。在每個類別和物種內(nèi)，檢測到的AS事件的數(shù)量在各組織21之間是可比的(圖1b和補(bǔ)充圖3)。相比之下，在包涵體頻率隨時(shí)間發(fā)生顯著變化的AS事件中(稱為“發(fā)育動態(tài)選擇性剪接”(DevAS)方法)，腦組織和睪丸脫穎而出，其DevAS事件的數(shù)量和比例比其他器官要大得多(圖1c，補(bǔ)充圖3和補(bǔ)充數(shù)據(jù)9)。在性成熟過程中，睪丸的細(xì)胞成分發(fā)生了根本性的變化，生精細(xì)胞成為主要的22、23細(xì)胞。這些細(xì)胞類型都有廣泛的開放染色質(zhì)，可以促進(jìn)各種類型的轉(zhuǎn)錄噪音，包括選擇性剪接23-26。我們一致地證明，性成熟的睪丸驅(qū)使睪丸中所有類別的DevAS水平都很高(圖1c)；也就是說，當(dāng)考慮到性成熟之前的發(fā)育階段時(shí)，睪丸中過量的DevAS就消失了(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2)。因此，睪丸的DevAS信號可能反映了細(xì)胞成分，而不是發(fā)育中的選擇性剪接程序開關(guān)。相比之下，當(dāng)分析局限于性成熟前階段時(shí)，大腦中過多的DevAS事件仍然存在。因此，大腦中明顯的DevAS信號可能反映了選擇性剪接對該器官發(fā)育的特殊重要性。

我們利用亞抽樣分析研究了不同物種發(fā)育采樣的差異如何解釋檢測到的選擇性剪接和DevAS事件數(shù)量的差異(圖1b，c和補(bǔ)充圖3)。這些分析表明，當(dāng)采樣方案匹配時(shí)，獼猴中的選擇性剪接和DevAS事件的數(shù)量，我們?nèi)狈υ缙诋a(chǎn)前數(shù)據(jù)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1)，變得與人類相似(補(bǔ)充圖3)。總之，我們的子抽樣分析表明，物種之間的主要差異是在靈長類動物中檢測到的選擇性剪接事件的數(shù)量多于其他物種(補(bǔ)充圖3)，這與成年后的選擇性剪接分析一致。然而，靈長類中DevAS事件的數(shù)量并不多這一事實(shí)表明，靈長類中檢測到的選擇性剪接事件的過量反映了靈長類中近中性(輕度有害)的轉(zhuǎn)錄噪聲，這與它們較低的有效種群數(shù)量(即較弱的凈化選擇)24，27有關(guān)。

考慮到大量的DevAS盒式外顯子，以及之前對這種選擇性剪接種類3、5、17、21的強(qiáng)烈關(guān)注，我們將所有后續(xù)的分析都集中在盒式外顯子上。

選擇性剪接在大腦和心臟發(fā)育中扮演著不成比例的角色。為了探索樣本之間的全球選擇性剪接關(guān)系，我們在每個物種(方法)中進(jìn)行了多維縮放(MDS)分析。樣本按器官聚集，對于心臟，特別是腦組織，樣本按發(fā)育階段排序(圖1d和補(bǔ)充圖4)。這種聚類表明，在發(fā)育過程中，特別是在大腦和心臟的發(fā)育過程中，不同的剪接程序會不斷分化。事實(shí)上，基于PSI相關(guān)性對發(fā)育選擇性剪接狀態(tài)與最早胚胎階段的比較表明，在發(fā)育過程中備選剪接模式有逐漸的分化，但大腦的比率要高得多(圖1e和補(bǔ)充圖4)。這與基因表達(dá)水平形成對比，在基因表達(dá)水平中，大腦不是異常值(圖1e和補(bǔ)充圖4)。睪丸中選擇性剪接對性成熟的相關(guān)性突然下降也可見于基因表達(dá)水平，這可能是由于具有廣泛轉(zhuǎn)錄噪聲23-26的主要生精細(xì)胞群體的出現(xiàn)(見上一節(jié))。因此，這種下降并不代表功能性選擇性剪接程序的切換，而是反映了由于細(xì)胞組成的根本變化，性成熟前后的選擇性剪接模式之間缺乏聯(lián)系。再加上腦組織中DevAS事件的較大比例(圖1c)，這些分析表明，替代剪接程序在大腦發(fā)育中扮演著不成比例的角色，在較小的程度上，心臟發(fā)育也是如此。然而，心臟的DevAS模式不那么明顯，可能是因?yàn)樵谖覀冏钤绲牟蓸与A段，心臟比大腦(和其他器官)更發(fā)達(dá)。

然后我們研究了DevAS的器官特異性。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)DevAS事件(64-84%取決于物種)是特定于一個器官的，這與成年后的觀察一致12。值得注意的是，在多個器官中有DevAS的盒式磁帶外顯子中，特定的器官對比其他器官更頻繁地被觀察到。選擇性剪接預(yù)計(jì)，前腦/大腦和后腦/小腦是最常見的配對(P<10?34，優(yōu)勢比(OR)=2.1-6.7，F(xiàn)isher‘s精確檢驗(yàn))，但令人驚訝的是，腎和肝臟對也過多(P<10?2 9，OR=3.0-7.7，F(xiàn)isher’s精確檢驗(yàn)；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)。這些結(jié)果表明，選擇性剪接程序的調(diào)控在器官之間是共享的，并可能是協(xié)調(diào)的。值得注意的是，大多數(shù)DevAS事件(以及一般的選擇性剪接事件)發(fā)生在具有廣泛空間表達(dá)譜的基因中(圖1f)，這一結(jié)果在具有不同外顯子數(shù)量的基因之間是一致的(補(bǔ)充圖5)。例如，人腦中75%的DevAS事件發(fā)生在具有廣泛空間表達(dá)的基因中(組織特異性<0.5；圖1f)。這些結(jié)果表明，DevAS可能允許在無處不在的表達(dá)基因中實(shí)現(xiàn)器官特異性發(fā)育功能。

高度保守的動態(tài)發(fā)育選擇性剪接。接下來，我們描述了器官間選擇性剪接的進(jìn)化保守性。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)(～65-81%)在所有物種中交替剪接的1：1的同源盒式外顯子在所有物種中至少在一個器官中顯示DevAS，幾乎所有(97%)在至少一個物種中都顯示DevAS。相比之下，在每個物種中交替剪接的外顯子中，只有~31-38%的在至少一個器官中顯示出DevAS。對1,441個同源盒式磁帶外顯子的

MDS分析(圖2a)反映了物種特異性的MDS分析(圖1和補(bǔ)充圖4)。樣本按器官聚集，對于心臟和腦組織，樣本按發(fā)育階段排序(圖2a)。器官主導(dǎo)的聚集性表明器官保存了DevAS信號。對盒式磁帶外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列(即潛在包含選擇性剪接順式調(diào)控序列28的序列)的分析進(jìn)一步支持了DevAS的強(qiáng)保守性，這表明DevAS的保守性比非DevAS事件高得多(圖2b；所有器官的P<10?10，Mann-Whitney U檢驗(yàn))，這與小鼠皮質(zhì)發(fā)育的結(jié)果一致。大腦中高度保守的DevAS事件的例子是DLG3的三個盒式外顯子，它編碼一種與學(xué)習(xí)障礙有關(guān)的突觸相關(guān)蛋白29，30(圖2c)。

DevAS的保守性表明，DevAS的譜系豐富了主動調(diào)節(jié)的功能選擇性剪接事件。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)在DevAS事件中保存閱讀框架的外顯子的比例比非DevAS事件高得多(圖2d；對于所有器官，P<10?10，比例測試)，這與小鼠皮層發(fā)育的工作一致16。此外，與其他選擇性剪接外顯子相比，DevAS外顯子顯著豐富了蛋白質(zhì)內(nèi)在無序區(qū)域的編碼潛力,即蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的潛在調(diào)節(jié)因子31(圖2e；除肝臟外，所有器官的P<0.005，比例檢驗(yàn))。

早期發(fā)展與后期發(fā)展的對比。蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)水平在最早發(fā)育階段的各個器官中最為相似，然后逐漸分化成不同的發(fā)育程序18。我們發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)育的推進(jìn)，選擇性剪接程序通過在器官之間逐漸分化，特別是對大腦(圖3a和補(bǔ)充圖6)，平行于這種表達(dá)模式的時(shí)間多樣化。睪丸中的不同剪接模式顯示出在性成熟方面

與其他器官的差異急劇增加，這與我們之前的觀察(圖1e，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2和補(bǔ)充圖4)和報(bào)告的基因表達(dá)水平的模式18是一致的。我們的分析還表明，在發(fā)育早期主要表達(dá)的基因顯示出比后期表達(dá)的基因更低的DevAS比率，特別是在大腦和睪丸中(圖3b)。這些觀察結(jié)果表明，DevAS在器官分化過程中起著重要作用。?

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化過程中，早期的Devas事件比晚期的Devas事件保存得更完好(圖3c和補(bǔ)充圖7)。這與編碼和非編碼基因表達(dá)18、32的差異模式是一致的。因此，盡管在發(fā)育早期使用的基因中DEVA的比率較低(圖3b)，但在這段時(shí)間內(nèi)，DevAS受到了更強(qiáng)的選擇性限制，理由是它在早期器官發(fā)生中的重要性。

基因表達(dá)水平的變化率在發(fā)育過程中并不是恒定的。一個主要的變化期與早期發(fā)育中器官特性的建立有關(guān)，另一個主要變化期與向成熟的特定器官功能的過渡有關(guān)18，32。我們發(fā)現(xiàn)，在所有物種的發(fā)育過程中，DevAS的PSI變化率和連續(xù)階段之間的基因表達(dá)水平高度相關(guān)(圖3d和補(bǔ)充圖8)。這種相關(guān)性意味著在發(fā)育過程中基因表達(dá)變化較大的時(shí)期(特別是所描述的兩個時(shí)期)也表現(xiàn)出較大的DevAS變化。然而，我們發(fā)現(xiàn)，這主要是通過不同的一組基因發(fā)生的。在發(fā)育變化的兩個主要時(shí)期，只有~10%(范圍：0-55%)的有顯著變化的基因也表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)變化。盡管有這種有限的重疊，我們?nèi)匀慌既坏赜^察到兩種機(jī)制改變的基因比預(yù)期的要多(在105個比較中，有30個用Fisher‘s Exact test Benjamini-Hochberg調(diào)整P<0.05；補(bǔ)充表2)?？傮w而言，我們的分析表明，總體上，尤其是關(guān)鍵的個體發(fā)育期的發(fā)育是由控制基因表達(dá)水平和選擇性剪接的程序相互作用形成的。

外顯子在發(fā)育過程中的使用。為了研究DevAS的時(shí)間模式，我們將每個器官的外顯子分為四種主要模式(圖4a，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4以及補(bǔ)充圖9和10)：在發(fā)育過程中包涵體頻率逐漸增加(稱為‘UP’)，包涵體頻率逐漸降低(‘DOWN’)，先增加后減少(‘UP-DOWN’)，以及先減少再增加(‘DOWN-UP’)。值得注意的是，在物種之間，大多數(shù)DevAS外顯子(59-95%)呈現(xiàn)上升或下降模式(分別為23-58%和24-58%；圖4A，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充圖10)。當(dāng)在整個開發(fā)過程中強(qiáng)制定期采樣時(shí)，我們獲得了類似的結(jié)果(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)?？傮w而言，UP模式傾向于在器官和物種中最普遍，這與之前對小鼠皮層16和心臟14發(fā)育的研究一致(圖4a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)。此外，80%的病例在兩個器官出現(xiàn)上下模式時(shí)，時(shí)間變化的方向是相同的。這種一致性支持發(fā)育的AS調(diào)節(jié)在器官之間協(xié)調(diào)(與器官對的過度表達(dá)一致；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)，并涉及共同的調(diào)節(jié)因子(下圖)。

這些特定的時(shí)間模式導(dǎo)致器官之間選擇性剪接的主要發(fā)育差異(圖4a和補(bǔ)充圖10)；也就是說，特定器官中盒式磁帶外顯子的上下模式通常伴隨著這些外顯子在其他器官中的低且非發(fā)育動態(tài)包含率。相反，向下和向下-向上模式通常伴隨著其余器官中這些外顯子的整體高/穩(wěn)定和非動態(tài)包含率。這些時(shí)空模式可能與早期的選擇性剪接程序有關(guān)，這些程序在器官之間非常相似，然后在發(fā)育過程中逐漸分化(圖3a)。

UP或DOWN盒式外顯子側(cè)翼內(nèi)含子的序列保守性和?？蛲?/p>

顯子的比例顯著高于UP或DOWN盒式外顯子(圖4b-d)。這些觀察表明，發(fā)育內(nèi)含物的增加比減少具有更大的功能相關(guān)性，這可能更多地對應(yīng)于另一種剪接噪音。我們始終在外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列中檢測到富集的內(nèi)含子剪接調(diào)控元件(ISRE)基序和其他六聚體序列(即潛在的內(nèi)含子剪接調(diào)控元件)數(shù)量顯著高于外顯子下方的內(nèi)含子序列(P<10?96，二項(xiàng)式檢驗(yàn)；圖4e，f)，這一結(jié)果對外顯子下采樣具有很強(qiáng)的魯棒性(補(bǔ)充圖11和方法)。這進(jìn)一步支持了包裹體的漸進(jìn)性增加，構(gòu)成了一種比包含物減少更規(guī)范和更具功能相關(guān)性的DevAS形式。然而，這兩種類型的高度保守的實(shí)例都存在(圖2c：外顯子2是一種保守的向上情況，外顯子1和3是向下的外顯子)。在大腦和心臟中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)大的UP模式，進(jìn)一步支持了DevAS在這些器官中的重要作用。在睪丸中也發(fā)現(xiàn)了它們，這可能表明性未成熟睪丸向成熟睪丸的轉(zhuǎn)變伴隨著新生生精細(xì)胞類型和/或體細(xì)胞支持細(xì)胞中外顯子的至少部分調(diào)節(jié)的PSI改變。

剪接因子(SFS)可以對外顯子的使用產(chǎn)生相反的影響，這取決于它們是結(jié)合到它們的基序上-還是在備選外顯子28的下游。為了尋找這樣的基序，我們檢查了具有向上或向下模式的DevAS事件的六聚體序列頻率。對于大腦和心臟，我們偶然檢測到位于上外顯子上游和下外顯子下游的過度表達(dá)的六角體序列的數(shù)量比預(yù)期的要多得多(P<10?10，費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)；補(bǔ)充圖12)。這些對比的基序定位表明，相應(yīng)的SFS在發(fā)育過程中促進(jìn)或抑制外顯子包含，這取決于六角體基序的內(nèi)含子位置及其發(fā)育活動動態(tài)，導(dǎo)致觀察到的向上和向下的發(fā)育包含模式。

我們發(fā)現(xiàn)了一個值得注意的案例，即ISRE基序在器官之間存在潛在的相反極性效應(yīng)。一個類似于AS調(diào)節(jié)因子的六聚體基序(ACTAAC)，顫抖同系物，KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合(QKI)，在發(fā)育中的大腦和心臟33，34中具有關(guān)鍵功能，在大腦的上外顯子上游和下外顯子下游富含，而在心臟中，它顯示出相反的模式(圖4G和補(bǔ)充圖13)。當(dāng)結(jié)合在盒外顯子35的上游時(shí)，QKI起到抑制子的作用，當(dāng)結(jié)合到盒外顯子35的下游時(shí)，QKI起到激活劑的作用。我們的觀察表明，QKI靶向外顯子的發(fā)育動力學(xué)不僅取決于QKI結(jié)合基序的定位，還取決于其跨調(diào)控環(huán)境的器官特異性發(fā)育動力學(xué)，即QKI和/或它可能與之相互作用的一個或幾個SFs的發(fā)育表達(dá)/活動模式(圖4g，右圖)。

我們的結(jié)果表明，在大腦中，QKI和/或潛在的協(xié)同調(diào)節(jié)因子的活性隨著時(shí)間的推移而降低，導(dǎo)致具有上游QKI基序的外顯子的包含子頻率增加(向上模式)，這是因?yàn)镼KI/協(xié)同調(diào)節(jié)因子對包涵體的抑制作用逐漸減弱。帶有下游QKI基序的外顯子表現(xiàn)出相反的行為。相反，在心臟，QKI/協(xié)同調(diào)節(jié)活性可能隨著時(shí)間的推移而增加，導(dǎo)致上游QKI基序的外顯子的包含率降低(向下模式)，因?yàn)镼KI/協(xié)同調(diào)節(jié)因子對包含性的抑制逐漸增強(qiáng)。帶有下游QKI基序的外顯子顯示出相反的模式。

微外顯子。微外顯子是一類特殊的非常短(3-27nt)且主要是框架保存盒外顯子36、37。我們發(fā)現(xiàn)，與其他器官相比，大腦中DEAS的微外顯子過多，從而擴(kuò)大了對成人大腦37的觀察(圖5a，b和補(bǔ)充圖14)。這種過剩明顯大于較長的盒式磁帶外顯子(稱為“大外顯子”)(圖5B和補(bǔ)充圖14)。然而，當(dāng)將分析限制在數(shù)量多得多的大外顯子(補(bǔ)充圖15)時(shí)，大腦中DevAS的總體過剩及其特定模式(圖1c和2a)仍然非常相似。雖然不那么明顯，但涉及微外顯子的DEAS事件過量也發(fā)生在大多數(shù)其他器官中(圖5b和補(bǔ)充圖14)。微外顯子中DEAS的富集是由微外顯子驅(qū)動的，在發(fā)育過程中PSI逐漸增加(向上模式)(圖5C和補(bǔ)充圖14)。然而，對于大腦中的大多數(shù)UP微外顯子，PSI的大部分增加發(fā)生在出生前(圖5d)。UP大外顯子在大腦中顯示的產(chǎn)前變化比例明顯小于UP微外顯子(圖5d；所有物種的P<10?4，費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn))。總體而言，我們的觀察顯示，微外顯子的包含率在發(fā)育過程中增加，這表明微外顯子在早期大腦發(fā)育中起著突出的作用。后一種觀點(diǎn)與微外顯子是神經(jīng)元特異性的，主要參與神經(jīng)發(fā)生37，38，以及與自閉癥相關(guān)的微外顯子調(diào)控失調(diào)是一致的，自閉癥37是一種與大腦發(fā)育早期主要表達(dá)的基因相關(guān)的紊亂。

以往的研究表明，微外顯子比大外顯子37、38更保守，功能更相關(guān)。聚焦于Devas外顯子，我們發(fā)現(xiàn)確實(shí)，微外顯子在其內(nèi)含

子側(cè)翼顯示出比大外顯子更高的序列保守性(圖5e)。此外，與Devas大外顯子相比，含有Devas的微外顯子的比例更大(~90%)，從而保持了閱讀框架(圖5f)。腦、心臟和肝/腎中具有高度保守的DevAS模式的微外顯子的例子分別存在于基因GDPD5、TMED2和PAPSS2中(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5-7)?？傊覀兊陌l(fā)現(xiàn)表明，微外顯子構(gòu)成了一類高度選擇性地保存的可供選擇的外顯子，在早期發(fā)育，特別是大腦的發(fā)育中起著重要作用。

新的外顯子誕生和外顯子交替。在成人組織中，新的外顯子通常在進(jìn)化過程中以選擇性剪接盒外顯子5，41，42的形式出現(xiàn)。因此，我們在器官發(fā)育的背景下評估了新的(內(nèi)部)盒式磁帶外顯子的起源和進(jìn)化(圖6a，補(bǔ)充數(shù)據(jù)10和方法)。我們發(fā)現(xiàn)，新的替代外顯子(即在真核生物進(jìn)化過程中出現(xiàn)的外顯子)在發(fā)育后期比早期使用得更頻繁(圖6b)。這種發(fā)展模式也可以在其他分子創(chuàng)新中觀察到，這可能是由于在促進(jìn)分子創(chuàng)新的發(fā)展過程中，功能約束逐漸減少所致。我們發(fā)現(xiàn)，就像在成人睪丸43中觀察到的那樣，非常年輕的盒式磁帶外顯子(即物種特有的)主要合并到睪丸異構(gòu)體中，而年齡較大的新外顯子(即出現(xiàn)在真獸類的祖先中)主要用于大腦(圖6c)。值得注意的是，年齡越大的新外顯子也顯示出更高比例的DEAS、平均PSI、幀保存和編碼潛力(圖6d-g)?？傮w而言，我們的發(fā)現(xiàn)與對全新基因的出現(xiàn)和“睪丸外”情況的觀察結(jié)果相一致42，44。我們認(rèn)為，新的哺乳動物外顯子的初始轉(zhuǎn)錄/剪接是由性成熟睪丸23、24中生殖細(xì)胞的允許轉(zhuǎn)錄環(huán)境促進(jìn)的。雖然這些新的外顯子中有許多仍然沒有功能，并最終消失了，但有一個子集在睪丸中進(jìn)化了功能角色。在更長的進(jìn)化期內(nèi)，這些新外顯子中的進(jìn)一步突變被固定，導(dǎo)致它們包含在其他器官中，并在其他器官中發(fā)揮功能，特別是大腦。

我們發(fā)現(xiàn)，40-50%的物種特異性新外顯子與轉(zhuǎn)座元件(TES)重疊，特別是短穿插核元件和長穿插核元件，這與以前的工作43，45是一致的。我們還發(fā)現(xiàn)，隨著外顯子進(jìn)化年齡的增加，新外顯子與TES強(qiáng)烈重疊的百分比逐漸下降(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8)。我們的觀察表明，與來自獨(dú)特序列的外顯子相反，TE衍生的外顯子大多沒有被選擇性地保留很長的進(jìn)化期。然而，也有可能TE衍生的外顯子的序列特征在更長的進(jìn)化過程中發(fā)生了無法辨認(rèn)的變化?；駻PP中有一個新出現(xiàn)的替代外顯子的例子，它起源于真獸類的共同祖先(圖6a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9)。這個外顯子的無義突變，主要包括在早期大腦發(fā)育中(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9)，導(dǎo)致人類大腦發(fā)育的嚴(yán)重?fù)p害46。我們還研究了新的可供選擇的外顯子的另一個進(jìn)化來源：構(gòu)成外顯子。

在我們稱之為“交替作用”(圖6a和補(bǔ)充數(shù)據(jù)11)的過程中，組成性外顯子在固定影響剪接的突變后進(jìn)化為盒外顯子47。交替的外顯子顯示出與新外顯子的幾個相似之處：從睪丸偏向于腦的包涵體(圖6h)，以及隨著進(jìn)化年齡的增加(與成人組織中的工作一致)，DEAS(圖6d)和框架保存外顯子(圖6f)的比例增加。然而，與交替外顯子起源于功能構(gòu)成外顯子的事實(shí)一致，并且與新的外顯子相反，幾乎所有的外顯子都有編碼能力(圖6g)，并且隨著進(jìn)化年齡的增加，平均PSI下降(圖6e)。這些觀察表明，較早的交替事件的更多實(shí)質(zhì)性和發(fā)育動態(tài)的跳過可能具有功能相關(guān)性，而不頻繁地排除年輕的(通常是擾亂幀的)外顯子可能主要反映了轉(zhuǎn)錄噪聲。選擇性剪接舉個例子，AMPD2基因中的一個外顯子只在靈長類動物中有選擇性(圖6a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)。這個外顯子的缺失，在發(fā)育過程中逐漸排除，特別是在大腦中(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)，與神經(jīng)退行性運(yùn)動神經(jīng)元疾病48有關(guān)。

討論

我們對7個物種的發(fā)育選擇性剪接圖譜的比較分析表明，在進(jìn)化過程中，DevAS比更頻繁的非動態(tài)選擇性剪接保存得更完整。DEVAS還顯示了多個功能，這些功能表明它總體上高度豐富了功能性的選擇性剪接事件，正如之前所建議的16。然而，不同器官、不同發(fā)育時(shí)期、不同外顯子使用模式、不同外顯子年齡和不同類型的盒外顯子，DevAS的程度和選擇模式不同。我們的工作為脊椎動物器官和物種間選擇性剪接的發(fā)育模式提供了一個全球視角。然而，它有一個重要限制，即塊狀組織RNA-SEQ數(shù)據(jù)通常不允許評估細(xì)胞成分變化的相對貢獻(xiàn)。