上一篇推文我們介紹了單細(xì)胞3'端轉(zhuǎn)錄組原理，這個(gè)推文我們將給大家圖解10x genomics 免疫組庫(kù)建庫(kù)原理。免疫組庫(kù)測(cè)序時(shí)一般會(huì)同時(shí)測(cè)V(D)J 區(qū)段的全長(zhǎng)序列和5’端轉(zhuǎn)錄組。
在介紹免疫組庫(kù)建庫(kù)原理之前，我們簡(jiǎn)單介紹一下免疫組庫(kù)測(cè)序有關(guān)的免疫學(xué)知識(shí)。
我們所說(shuō)的免疫組庫(kù)測(cè)序，實(shí)際上是測(cè)B淋巴細(xì)胞核T淋巴，B細(xì)胞上負(fù)責(zé)識(shí)別并特異結(jié)合抗原的膜表面免疫球蛋白，我們稱為B-cell receptor(BCR)，BCR是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。T細(xì)胞上特異識(shí)別并特異結(jié)合抗原的分子為T(mén) cell receptor(TCR), TCR分子也屬于免疫球蛋白超家族, 由α、β兩條肽鏈組成。
編碼BCR/TCR的4個(gè)基因簇V(可變區(qū))、D（高變區(qū)）、J（編碼蛋白連接v、c區(qū)的結(jié)合區(qū)）、C（恒定區(qū)） ，B(T)細(xì)胞通過(guò)V(D)J重組，使BCR/TCR基因序列極為豐富，但細(xì)胞只表達(dá)一種特定的BCR(TCR)，也就是只能識(shí)別一種抗原，如下圖一(圖片來(lái)源https://medicine.yale.edu/keck/ycga/sequencing/10x/singcellsequencing/)。
圖一中BCR和Antibody(抗體)的關(guān)系我們用圖二(圖片來(lái)源http://www.futureforum.org.cn/cn/nav/detail/456.html)展示，B細(xì)胞受到抗原刺激后增殖分化被激活，分化的其中一個(gè)方向是分化成記憶B細(xì)胞，另一個(gè)方向是分化成漿細(xì)胞。漿細(xì)胞合成抗體多肽并分泌到細(xì)胞外執(zhí)行功能。所以BCR分為在B細(xì)胞膜上的膜型，和B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞后產(chǎn)生的我們成為抗體的分泌型。
另外，受抗原刺激的成熟B細(xì)胞在生發(fā)中心進(jìn)行增值分化的過(guò)程中VD區(qū)的基因可以發(fā)生隨機(jī)突變，以使新克隆生成B細(xì)胞的BCR和抗原結(jié)合更緊密，如下圖三所示
V(D)J序列多樣性的集合我們稱為為免疫組庫(kù)（Immune Repertoire, IR）,通過(guò)高通量測(cè)序，我們可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)譜和免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率上同時(shí)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄本和免疫組庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。
下面我們以圖解形式介紹單細(xì)胞免疫組庫(kù)構(gòu)建原理：
1.?B細(xì)胞或者T細(xì)胞里，V(D)J 區(qū)段是在mRNA 的5'端，所以和Gel Bead表面攜帶的Barcode和UMI所在的核算序列緊挨著的是mRNA的5‘端，以便捕獲全長(zhǎng)的V(D)J序列，如圖四。
2.GEMs的生成，每個(gè)GEM里含有Gel Beads、單個(gè)細(xì)胞、酶的混合物，如圖五。
3.Gel bead上的Barcode序列是怎樣連接上RNA分子的5’端？
如圖六所示，在每一個(gè)單獨(dú)的GEM里，除了 Gel Bead表面攜帶的Barcode和UMI所在的核酸序列，還有游離的poly-dT作為引物來(lái)結(jié)合RNA 3'端 poly(A)尾巴來(lái)擴(kuò)增得到全長(zhǎng)cDNA，這一步是發(fā)生在每個(gè)GEM內(nèi)部。
4.GEM裂解后，所有細(xì)胞cDNA混在一起進(jìn)行擴(kuò)增以達(dá)到建庫(kù)要求，擴(kuò)增后的產(chǎn)物分成2份或3份同時(shí)進(jìn)行TCR/BCR的V(D)JJ文庫(kù)構(gòu)建和5’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建，獲得每個(gè)細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J全長(zhǎng)序列。來(lái)自同一細(xì)胞的VDJ文庫(kù)序列和轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)序列有相同的細(xì)胞標(biāo)簽(Barcode)，這樣每個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以對(duì)應(yīng)該細(xì)胞的V(D)J信息.
5.?第一個(gè)文庫(kù)：V(D)J建庫(kù)構(gòu)建
V(D)J建庫(kù)要進(jìn)行巢式PCR，我們先看一下什么是巢式PCR？
巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片段，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。
6. V(D)J 全長(zhǎng)序列獲得原理：
V(D)J的區(qū)段的長(zhǎng)度通常是650bp左右，而二代測(cè)序雙端測(cè)序最多可以測(cè)150x2=300bp的序列。但是有同一UMI的reads屬于同一條mRNA 擴(kuò)增而來(lái)，我們用下圖粉紅色的UMI Groups 為例，圖解原理，見(jiàn)圖十。
7. 第二個(gè)文庫(kù)：
5’端mRNA文庫(kù)構(gòu)建，參考單細(xì)胞建庫(kù)技術(shù)詳細(xì)介紹里文庫(kù)結(jié)構(gòu)介紹。
參考文獻(xiàn)：
Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients’ B cells. Cell, 2020.
Selecting the Correct Single Cell Immune Profiling User Guide. https://support.10xgenomics.com/
Practical guidelines for B-cell receptor repertoire sequencing analysis. Genome medicine, 2015.
