1. Serrat X, et al. (2014) EMS mutagenesis in mature seed-derived rice calli as a new method for rapidly obtaining TILLING mutant populations. Plant Methods 10(1):5.

背景技術(shù)TILLING（靶向誘導(dǎo)的基因組中的局部損傷）是一種反向遺傳方法，其將化學(xué)誘變與高通量全基因組篩選相結(jié)合，用于感興趣的基因中的點(diǎn)突變檢測(cè)。然而，這種突變發(fā)現(xiàn)方法面臨著如何獲得具有足夠高的突變密度的突變?nèi)后w的特殊問(wèn)題。此外，在分析基因型可以開始之前，植物誘變方案需要連續(xù)兩代（M1，M2）進(jìn)行突變定位。\ n結(jié)果：在此，我們描述了一種基于甲磺酸乙酯（EMS）的水稻新的TILLING方法，成熟種子來(lái)源的愈傷組織的誘變和體外再生植物的直接篩選。當(dāng)植物篩選兩個(gè)衰老相關(guān)基因時(shí)，獲得高誘變率（即每451Kb中一個(gè)突變）。篩選在來(lái)自6912突變體群體的2400名個(gè)體中進(jìn)行。確定了15個(gè)點(diǎn)突變中的7個(gè)意義上的變異突變。\ n \ n結(jié)論：這種新策略在時(shí)間節(jié)省，溫室空間和突變植物種群生成期間的工作方面（即超過(guò)8個(gè)月）具有顯著的優(yōu)勢(shì)。此外，這種有效的化學(xué)誘變方案確保了高誘變率，從而通過(guò)誘變體積減少而節(jié)省了廢物去除成本和所需的誘變劑總量。

背景
水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的糧食作物之一。它也是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的典型谷物植物[1]，由于其相對(duì)于其他谷物的小基因組大小，整個(gè)基因組序列的可用性[2]，易于轉(zhuǎn)化和再生，以及多樣性的可用性的突變體。由于水稻基因組的測(cè)序于2004年12月完成[2]，功能基因組學(xué)被用于確定所有大約50,000個(gè)注釋基因的功能[3,4]。通過(guò)開發(fā)各種基因敲除策略已經(jīng)達(dá)到了這一目標(biāo)[5-7]。
有3種方法可以通過(guò)以下方式誘導(dǎo)突變：1）生物制劑如轉(zhuǎn)座子和T-DNA，2）物理試劑，如快中子，紫外線和X射線輻射，或3）化學(xué)藥劑如N - 甲基-N-亞硝基脲（MNU），1,2：3,4-二環(huán)氧丁烷（DEB）或甲磺酸乙酯（EMS）。在這些化合物中，EMS已經(jīng)成為植物中最有效，最可靠，最強(qiáng)大和最常用的化學(xué)誘變劑[8]。 EMS主要誘導(dǎo)產(chǎn)生C / G至T / A轉(zhuǎn)換的C?Vto-T取代[9,10]，而在低頻下，EMS通過(guò)7-乙基鳥嘌呤生成G / C至C / G或G / C至T / A轉(zhuǎn)換水解或A / T到G / C轉(zhuǎn)換通過(guò)3-乙基腺嘌呤配對(duì)錯(cuò)誤[9-12]。
長(zhǎng)期以來(lái)，已經(jīng)將照射和化學(xué)誘變用于產(chǎn)生用于育種的突變植物[13,14]。突變的分子篩選在化學(xué)誘變劑產(chǎn)生小缺失和點(diǎn)突變得到改善的效率之后得到發(fā)展[8,9,15,16]，DNA測(cè)序允許鑒定這種點(diǎn)突變。然而，在大量人口中的直接測(cè)序是一個(gè)緩慢而昂貴的過(guò)程。因此，開發(fā)了基于物理性質(zhì)的幾種突變檢測(cè)技術(shù)[17-24]，之前酶不匹配檢測(cè)方法為高效突變種群篩選提供了關(guān)鍵。從曲霉菌[25]，Vigna radiata [26]或Penicillium [27]獲得的內(nèi)切核酸酶是用于檢測(cè)DNA錯(cuò)配的第一種酶。 Oleykowski等[28]通過(guò)使用從電影步驟獲得的來(lái)自枸杞子的CEL I內(nèi)切核酸酶改進(jìn)了該技術(shù)，從而為高通量篩選技術(shù)鋪路。從那時(shí)起，酶檢測(cè)方法與高通量基因分型結(jié)合已被改進(jìn)，用于遺傳多態(tài)性的有效檢測(cè)[29-32]。因此，在模型生物體中使用輻射和化學(xué)誘變用于功能基因組學(xué)研究的興趣越來(lái)越大[33,34]。
化學(xué)誘導(dǎo)的突變體種群已經(jīng)在不同的植物物種中產(chǎn)生[11]，并有效篩選了靶向誘導(dǎo)的基因組（TILLING）高通量篩選方案中的局部損傷[35-37]。這些結(jié)合隨機(jī)化學(xué)誘變與靶基因的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，異源雙鏈體形成和一系列等位基因變化的鑒定[38]，通過(guò)使用酶學(xué)錯(cuò)配切割和電泳。在具有大基因組的植物物種中實(shí)現(xiàn)全基因組飽和突變體種群具有挑戰(zhàn)性。小型基因組物種如水稻更適合TILLING [30,39,40]。結(jié)果，許多水稻突變體群體已經(jīng)使用這種技術(shù)進(jìn)行了有效的篩選[36,41-43]。
在TILLING化學(xué)誘變方法中，將發(fā)芽種子在誘變?nèi)芤褐蟹跤?strong>直接從誘變處理產(chǎn)生的第一代（M1）不能篩選，因?yàn)榇蠖鄶?shù)產(chǎn)生的突變是體細(xì)胞的，不能傳播到后代[30]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，M1突變種群必須生長(zhǎng)然后自我受精。 M1性結(jié)構(gòu)中的突變可以產(chǎn)生整個(gè)突變的M2后代，從而避免由嵌合引起的任何歧義。所得的M2后代可以篩選出突變。
目前可獲得的組織培養(yǎng)方法和誘變技術(shù)可顯著縮短育種過(guò)程，克服一些重大的農(nóng)藝和環(huán)境問(wèn)題。在大多數(shù)情況下，胚胎來(lái)源的水稻愈傷組織再生僅由幾個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生。因此，可以直接篩選來(lái)自突變愈傷組織的再生M1小植株，而無(wú)需等待自花授粉的M2群體。已經(jīng)報(bào)道了在未來(lái)的胚胎，來(lái)自成熟種子的愈傷組織或最近受精的小穗中的單個(gè)合子細(xì)胞的水稻誘變育種的嘗試很少，已報(bào)道[44-47]。最近報(bào)道了用于突變體表型檢測(cè)的懸浮培養(yǎng)的水稻細(xì)胞的誘變[48]。然而，迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了為了獲得TILLING的突變種群，在成熟種子來(lái)源的水稻愈傷組織中沒有化學(xué)誘變的研究。
這項(xiàng)工作的目的是實(shí)施一個(gè)新的TILLING策略，基于來(lái)自EMS誘變的胚胎來(lái)源的愈傷組織的植物突變種群的生產(chǎn)，然后在再生植物上進(jìn)行突變篩選。這種突變篩選集中在與衰老有關(guān)的兩個(gè)基因上，因?yàn)槊磕旯任镒魑锏陌l(fā)育過(guò)程與繁殖期重疊，并且可能在不利的環(huán)境條件下過(guò)早誘導(dǎo)時(shí)可以降低作物產(chǎn)量。