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又到了單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的時(shí)間了，今天我們參考的文獻(xiàn)在Recurrence of cancer cell states across diverse tumors and their interactions with the microenvironment，單細(xì)胞空間對(duì)于腫瘤極其微環(huán)境的研究還是主流啊~~~

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ABSTRACT

雖然遺傳腫瘤異質(zhì)性早已被認(rèn)識(shí)到，但最近的工作揭示了癌細(xì)胞在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平上的顯著差異。在單個(gè)癌癥類型的單細(xì)胞水平上對(duì)腫瘤進(jìn)行分析表明，轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性被表征成癌細(xì)胞狀態(tài)，這意味著不同的細(xì)胞狀態(tài)可能代表穩(wěn)定和功能單元，在腫瘤維持和進(jìn)展中具有互補(bǔ)作用。然而，目前尚不清楚這些狀態(tài)在多大程度上跨越了腫瘤類型，構(gòu)成了癌癥的一般特征。此外，癌細(xì)胞狀態(tài)在腫瘤進(jìn)展中的作用及其與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的特定相互作用仍有待闡明。在這里，對(duì) 15 種癌癥類型進(jìn)行了泛癌單細(xì)胞 RNA-Seq 分析，并確定了 16 個(gè)基因模塊的目錄，這些模塊的表達(dá)定義了復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞狀態(tài)，包括"stress”、‘interferon response’, ‘epithelial-mesenchymal transition’, ‘metal response’, ‘basal’ and ‘ciliated’。使用小鼠模型，發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊的誘導(dǎo)因腫瘤位置而異，并在淋巴細(xì)胞消除后減弱。此外，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析進(jìn)一步將癌細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)與腫瘤微環(huán)境中的 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聯(lián)系起來(lái)。

Introduction

Transcriptional heterogeneity in cancer is increasingly recognized as a driver of tumor progression,metastasis and treatment failure(癌癥中的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性越來(lái)越被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療失敗的驅(qū)動(dòng)因素). Single-cell RNA-Sequencing (scRNA-Seq) has enabled the unbiased transcriptomic profiling of individual tumor cells and has revealed a striking amount of heterogeneity among malignant cells of the same tumor(單細(xì)胞確實(shí)是表征腫瘤最好的研究手段). Furthermore, evidence has emerged suggesting that transcriptional heterogeneity is organized into modules of co-expressed genes（腫瘤基因模塊）. Data from glioblastoma, oligodendroglioma, astrocytoma, head and neck cancer and melanoma among others, indicates that, within a tumor, cancer cells are heterogeneous in their degree of differentiation,ranging from stem- or progenitor-like to fully differentiated（在腫瘤內(nèi)，癌細(xì)胞的分化程度是異質(zhì)的，從干細(xì)胞樣或祖細(xì)胞樣到完全分化）. These studies performed in a variety of cancer types have also shown the existence of cancer cell states related to stress response, interferon response, and hypoxia. While certain states have been found in multiple studies, a general catalog of cell states across cancer types remains to be established. Such a coherent framework - if it exists - would allow us to search for common themes across cancer types and to understand how tumors are organized independently of their origin.

Beyond malignant cells, tumors are composed of a complex microenvironment including immune and stromal cells, which also play critical roles in tumorigenesis（除了惡性細(xì)胞，腫瘤由復(fù)雜的微環(huán)境組成，包括免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，它們?cè)谀[瘤發(fā)生中也起著關(guān)鍵作用）. In particular, the clinical success of immunotherapy across multiple cancers hints at commonalities in the interactions between cancer cells and the tumor microenvironment (TME). Causative links have been drawn between specific elements of the TME and cancer cell states. In one study of head and neck cancer, a population of partial epithelial-mesenchymal transition (pEMT) cancer cells at the leading edge of tumors was shown to interact with cancer-associated fibroblasts and mediate invasion. In glioblastoma and triple-negative breast cancer, factors of the TME appear to induce malignant cells to adopt a stem-like state. These works point to a need for a systematic analysis of cancer cell states, with a particular focus on the relation to the non-malignant cell types of the TME（這些工作表明需要對(duì)癌細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)分析，特別關(guān)注與 TME 的非惡性細(xì)胞類型的關(guān)系）.

Here, we characterize recurrent cancer cell states and their relationship with the TME by systematically assaying 15 cancer types to identify a catalog of recurrent cancer cell states using a gene-centric approach（腫瘤劃類）. Analyzing scRNA-Seq data from previously published data as well as newly collected tumors, we identified 16 coherent gene modules and quantified their expression in malignant cells of each sample（模塊表征腫瘤細(xì)胞）. This catalog includes modules present in all studied tumors, as well as others that are specific to particular sets of cancer types（該目錄包括存在于所有研究腫瘤中的模塊，以及特定于特定癌癥類型集的其他模塊）. To further study the cancer cells states, we used experimental models to perturb the tumor microenvironment and test for differential effects on the cancer cell states（擾亂腫瘤微環(huán)境并測(cè)試對(duì)癌細(xì)胞狀態(tài)的不同影響）.While some of the states are related to known aspects of cancer biology, we present evidence that these processes are heterogeneously deployed by cells of the same tumor, and that this heterogeneity recurs across a wide range of cancer types. A detailed analysis of the interferon response module further led us to study its dependencies in vivo in the context of TME perturbations and to establish its proximity to macrophages and T cells across cancer types. Overall, the catalog of cancer cell states is a coherent representation of the makeup of a tumor, and provides a framework for the analysis and testing of the features of tumorigenesis（為分析和測(cè)試腫瘤發(fā)生的特征提供框架）。

Result

Recurring gene modules across diverse cancer types

在手術(shù)后立即收集了 19 個(gè)未經(jīng)治療的新鮮原發(fā)患者腫瘤，涵蓋 9 種癌癥類型。分離每個(gè)腫瘤以獲得單細(xì)胞懸液，并在沒(méi)有事先分選的情況下處理 scRNA-Seq，以確保對(duì)腫瘤細(xì)胞組成的公正評(píng)估。腫瘤收集包括 9 種癌癥類型：卵巢癌 (OVCA)、子宮內(nèi)膜癌 (UCEC)、乳腺癌 (BRCA)、前列腺癌 (PRAD)、腎癌 (KIRC)、肝癌 (LIHC)、結(jié)腸癌 (COAD) 和胰腺癌 (PDAC) ，以及一種非上皮癌類型，胃腸道間質(zhì)瘤 (GIST)。首先通過(guò)使用標(biāo)記基因、singleR 注釋和推斷的拷貝數(shù)變異的組合分析轉(zhuǎn)錄組，并控制雙細(xì)胞的可能性來(lái)識(shí)別數(shù)據(jù)集中的惡性細(xì)胞。在樣本中，注釋了 9,036 個(gè)惡性細(xì)胞和 18,546 個(gè)非惡性細(xì)胞。為了擴(kuò)展數(shù)據(jù)集，還在先前發(fā)表的腫瘤中進(jìn)行了這種分析，包括額外的 PDAC 和 LIHC，以及額外的腫瘤類型：膽管癌 (CHCA)、肺腺癌 (LUAD)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (HNSC)、皮膚鱗狀細(xì)胞癌 (SKSC)、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM)7 和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (OGD)，共產(chǎn)生來(lái)自 62 個(gè)未經(jīng)治療的原發(fā)腫瘤的 19,942 個(gè)惡性細(xì)胞，涵蓋 15 種癌癥類型。

定義細(xì)胞狀態(tài)的方法首先涉及對(duì)底層基因模塊進(jìn)行劃類，隨后最近的工作已將基因模塊確定為細(xì)胞狀態(tài)的定義特征（這個(gè)狀態(tài)的定義類似于hallmark）。這是一種靈活的方法，因?yàn)樗试S細(xì)胞表達(dá)模塊的組合，從而允許細(xì)胞狀態(tài)的復(fù)雜性。使用非負(fù)矩陣分解 (NMF，又是NMF，運(yùn)用的太多了) 分析了惡性細(xì)胞，以將基因模塊識(shí)別為一組共表達(dá)的基因。我們的方法檢測(cè)樣本中共表達(dá)的基因組，即在細(xì)胞亞群中一致表達(dá)的基因組。為了在腫瘤中尋找重復(fù)出現(xiàn)的基因模塊，比較了已識(shí)別模塊的基因組成。通過(guò)在基因模塊而不是表達(dá)矩陣的水平上進(jìn)行整合，樣本和研究之間的技術(shù)變化的影響是有限的。盡管在各種癌癥類型中獨(dú)立鑒定了這些模塊——因此不假設(shè)復(fù)發(fā)——發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中獲得的模塊顯著重疊。重要的是，這種重復(fù)而不是唯一性的發(fā)現(xiàn)也不是批次效應(yīng)的結(jié)果。

基因模塊的重復(fù)能夠構(gòu)建 16 個(gè)共有模塊的目錄，每個(gè)模塊的中位數(shù)為 37 個(gè)基因。為了確定模塊是否顯著存在于每個(gè)腫瘤的癌細(xì)胞群中，使用了基因集過(guò)度分散度量。一些模塊豐富了特定的器官系統(tǒng)（如大腦或婦科器官），而其他模塊則涵蓋了多個(gè)器官系統(tǒng)和組織學(xué)。還在代表來(lái)自輸卵管、乳房和肝臟的正常上皮的獨(dú)立數(shù)據(jù)集中測(cè)試了模塊的過(guò)度分散，以詢問(wèn)模塊是否反映了在正常組織中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性的重建。對(duì)于大多數(shù)模塊，發(fā)現(xiàn)正常上皮樣本中的過(guò)度分散較低，這表明它們?cè)谡＝M織中的表達(dá)差異不大。然而，模塊目錄確實(shí)在一定程度上在正常組織中檢測(cè)到的事實(shí)表明，這些模塊不是特定于癌癥的，而是從現(xiàn)有模塊中選擇出來(lái)的，并且表達(dá)更加異質(zhì)。還研究了模塊的基因組成和癌癥類型特異性，將與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的模塊與與細(xì)胞身份相關(guān)的模塊區(qū)分開(kāi)來(lái)。

正如預(yù)期的那樣，恢復(fù)了一個(gè)由細(xì)胞周期基因（例如 TOP2A、PCNA）組成的高重復(fù)性模塊，捕獲采樣時(shí)循環(huán)的任何腫瘤中的癌細(xì)胞亞群。另一個(gè)在腫瘤類型中反復(fù)出現(xiàn)的過(guò)程是應(yīng)激反應(yīng)（例如，JUN、FOS、HSPA1B），此前已對(duì)其進(jìn)行了描述并證明其在黑色素瘤的耐藥性中起作用。還在下面提供了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為在沒(méi)有解離的情況下癌細(xì)胞中這種狀態(tài)的體內(nèi)存在提供了額外的支持。

已在轉(zhuǎn)移性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)的干擾素反應(yīng)模塊廣泛存在，表明惡性細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)在一系列實(shí)體瘤類型中是異質(zhì)的。除了干擾素刺激的基因，如 STAT1 和 IFIT1，該模塊還包含抗原呈遞的成分，干擾素的一種充分表征的作用，包括 MHC I 基因，如 HLA-A 和 MHC II 基因，包括 HLA-DRA。雖然 MHC II 表達(dá)通常與專職抗原呈遞細(xì)胞相關(guān)，但該途徑也已顯示在正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞中表達(dá)。干擾素反應(yīng)通常起到募集和激活免疫細(xì)胞的防御反應(yīng)的作用，并已在癌癥中得到廣泛研究。在這種情況下，干擾素配體可能由癌細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC)（對(duì)于 I 型干擾素、IFNα 和 IFNβ）或自然殺傷 (NK) 和 T 細(xì)胞（對(duì)于 IFNγ）分泌。或者，干擾素反應(yīng)可以是癌細(xì)胞內(nèi)在的，即獨(dú)立于其他細(xì)胞類型的信號(hào)而激活；事實(shí)上，最近一項(xiàng)比較體外癌細(xì)胞系基因模塊的研究也確定了一個(gè)干擾素反應(yīng)模塊，支持了 TME 獨(dú)立反應(yīng)的可能性。

在一系列癌癥類型中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與代謝過(guò)程相關(guān)的模塊：缺氧模塊（例如，VEGF、ADM）和氧化磷酸化模塊（例如，ATP5H、LAMTOR2）。實(shí)體瘤中對(duì)缺氧的代謝適應(yīng)，伴隨著糖酵解增加和血管生成的誘導(dǎo)，與癌癥進(jìn)展、耐藥性、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。盡管如此，最近的研究表明氧化磷酸化在幾種癌癥類型中起作用，這表明癌細(xì)胞可能依靠糖酵解和氧化磷酸化來(lái)產(chǎn)生能量。 金屬硫蛋白基因的另一個(gè)基因模塊——在此稱為金屬反應(yīng)模塊——可能在幾種癌癥類型的增殖和耐藥性中起作用。

另一組模塊對(duì)應(yīng)于細(xì)胞身份，似乎與組織和細(xì)胞起源有關(guān)。所分析的大多數(shù)腫瘤是上皮起源的，因此確定了與已知上皮細(xì)胞類型標(biāo)記重疊的模塊：肺泡模塊（例如，AGER、CAV1），它特別存在于 LUAD59-61 中，以及基底（例如，KRT5 和 KRT15）、鱗狀（例如，KLK10、LY6D）和腺（例如，CLU、MUC5B）細(xì)胞模塊。由纖毛相關(guān)基因（例如 FOXJ1、PIFO）組成的模塊存在于婦科腫瘤以及 LUAD 和 GBM 中。在卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤中，該模塊僅存在于子宮內(nèi)膜樣樣本（OVCA NYU2-3、UCEC NYU2-3）中，而不存在于高級(jí)別漿液性樣本（OVCA NYU1、UCEC NYU1）中，表明纖毛形成是一個(gè)特征子宮內(nèi)膜樣組織學(xué)。該模塊在正常輸卵管和肺上皮組織中的存在表明其在癌癥中的差異表達(dá)反映了起源組織的異質(zhì)性。在腫瘤內(nèi)觀察到的分化模塊的異質(zhì)表達(dá)可以從臨床病理學(xué)的角度提供對(duì)腫瘤結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)的理解，其中評(píng)估每個(gè)腫瘤的等級(jí)和組織學(xué)亞型。

跨越多種癌癥類型的兩個(gè)模塊與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 相關(guān)：完整間充質(zhì)模塊 (cEMT)（例如 COL1A1、FN1）和部分間充質(zhì)模塊 (pEMT)（例如 LAMC2、VIM）缺乏典型的間充質(zhì)標(biāo)志物，如膠原基因。 pEMT 模塊最近在 HNSC10 和 SKSC31 中得到表征，但也在 GBM7 中發(fā)現(xiàn)，這表明來(lái)自不同譜系的細(xì)胞在癌癥中趨同于這種特性。在少數(shù)樣本中檢測(cè)到 cEMT 模塊的存在，但包括一系列癌癥類型：主要是 PDAC、CHCA、LUAD 和 GBM。最近的一項(xiàng)研究表明，pEMT 和 cEMT 可以發(fā)生在一系列癌癥類型中，并且可能代表了兩種途徑，它們?nèi)诤狭碎g充質(zhì)分化所賦予的表型特性，包括遷移和耐藥性。使用 TCGA 數(shù)據(jù)，確實(shí)發(fā)現(xiàn) pEMT 基因模塊的表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存期降低有關(guān)。

最后，確定了三個(gè)神經(jīng)癌癥特異性模塊：星形膠質(zhì)細(xì)胞 (AC) 樣（例如 APOE、ALDOC）、少突膠質(zhì)祖細(xì)胞 (OPC) 樣（例如 OLIG1、OLIG2）和神經(jīng)祖細(xì)胞 (NPC) 樣（例如 DLX1 , DLX5) 模塊。

這些模塊在一系列癌癥類型中的廣泛發(fā)生突出了分化程序的重新部署以及癌癥和正常組織中不同的表達(dá)水平。此外，雖然已鑒定的許多基因與癌癥生物學(xué)的各個(gè)方面有關(guān)，但單細(xì)胞方法使我們能夠證明它們?cè)谀[瘤的惡性細(xì)胞中異質(zhì)表達(dá)，并且通常在惡性上皮細(xì)胞中表達(dá)水平高于正常上皮細(xì)胞。

為了測(cè)試是否也可以使用獨(dú)立的方法檢測(cè) 16 個(gè)模塊的類別，使用了 SCENIC，這是一種識(shí)別表達(dá)相關(guān)且受相同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因的方法。發(fā)現(xiàn)我們目錄中的每個(gè)模塊都與幾個(gè) SCENIC 調(diào)節(jié)子有顯著的重疊。例如，干擾素反應(yīng)模塊與幾個(gè)用轉(zhuǎn)錄因子 STAT1 和 IRF1 注釋的 SCENIC 調(diào)節(jié)子重疊。

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Defining cancer cell states by gene module expression

Having established the catalog of cancer gene modules, we next sought to understand how they are generally assembled at the level of individual cells（接下來(lái)試圖了解它們通常是如何在單個(gè)細(xì)胞水平上組裝的）. In particular, we asked whether cells are constrained in which modules or combinations of modules they can express. For this, we scored each malignant cell for the expression of each of the modules. In the SKSC Ji1 sample, for example,expression of basal, squamous and cycling modules was mutually exclusive, but each of these had co-expression with the stress or pEMT module. More generally, we found that most cells express a combination of modules, though not all combinations are possible. These results support the notion that, in defining a cancer cell state, it is crucial to examine the complete set of gene modules expressed（檢查表達(dá)的完整基因模塊集至關(guān)重要）。

由于模塊在癌癥類型中反復(fù)出現(xiàn)，推斷細(xì)胞模塊評(píng)分可以作為比較不同患者癌細(xì)胞的自然軸。最值得注意的是，該空間中的癌細(xì)胞不按患者或癌癥類型分組，而是按其表達(dá)最高的模塊分組。這與以下發(fā)現(xiàn)形成鮮明對(duì)比：在基因表達(dá)空間中，癌細(xì)胞按患者聚集，并在去除個(gè)別基因引起的變異時(shí)突出癌癥類型的共性。如 SKSC Ji1 所述，某些模塊之間存在一定程度的共表達(dá)：例如，pEMT 與壓力和干擾素反應(yīng)共表達(dá)。連同細(xì)胞不形成不同簇的事實(shí)，這支持了癌細(xì)胞狀態(tài)通常不代表離散實(shí)體的觀點(diǎn)。然而，我們確實(shí)觀察到了與表達(dá)周期或纖毛模塊的細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的離散cluster。在基于基因表達(dá)的降維中單獨(dú)檢查腫瘤時(shí)，也會(huì)識(shí)別這些cluster，因此不是模塊得分降維的偽影。

由于某些模塊也存在于非癌癥樣本中，我們query表達(dá)每個(gè)模塊的細(xì)胞比例是否在惡性和非惡性上皮之間有所不同。為此，將惡性細(xì)胞中的模塊表達(dá)頻率與匹配樣本中的非惡性細(xì)胞中的模塊表達(dá)頻率進(jìn)行了比較。而對(duì)于 LUAD、SKSC 和 THCA，我們與配對(duì)的相鄰正常樣本的上皮細(xì)胞進(jìn)行了比較，而在 PDAC 中，來(lái)自相同樣本的非惡性導(dǎo)管細(xì)胞用作配對(duì)的正常比較。

相對(duì)于正常，pEMT 模塊在所有三種癌癥類型中的表達(dá)頻率更高，這與 EMT 在上皮癌中的常見(jiàn)發(fā)生率一致。相對(duì)于正常，干擾素反應(yīng)模塊在 LUAD 和 SKSC 中的表達(dá)頻率增加，但在 PDAC 中沒(méi)有變化。這可能部分解釋為用作參考的導(dǎo)管細(xì)胞是腫瘤本身的一部分，并暴露于 TME。

正常肺和皮膚具有鱗狀成分，一致觀察到腫瘤樣品中鱗狀表達(dá)沒(méi)有差異。相比之下，相對(duì)于正常導(dǎo)管細(xì)胞，在 PDAC 中誘導(dǎo)了鱗狀模塊，表明惡性細(xì)胞群中的鱗狀分化。對(duì)于基礎(chǔ)模塊觀察到類似的趨勢(shì)?；赽ulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)提出了幾種 PDAC 分類，包括經(jīng)典亞型（腺體基因的高表達(dá)，包括 TFF1 和 CEACAM6）和基底亞型（鱗狀和基底基因的高表達(dá)，包括 LY6D 和 KRT15）之間的區(qū)別。盡管鱗狀細(xì)胞胰腺癌很少見(jiàn)，但 PDAC 中鱗狀細(xì)胞表達(dá)頻率的增加表明部分化生向鱗狀細(xì)胞程序轉(zhuǎn)變是常見(jiàn)的。 LUAD 和 PDAC 中腺體模塊的表達(dá)相對(duì)于它們的正常對(duì)應(yīng)物沒(méi)有變化，但相對(duì)于正常皮膚在 SKSC 中增加。這種模式表明，惡性細(xì)胞群保留與其細(xì)胞來(lái)源類型相關(guān)的模塊表達(dá)（例如，保留 SKSC 中的鱗狀模塊），并進(jìn)一步部署來(lái)自其他細(xì)胞類型的基因模塊（增加 SKSC 中腺模塊的表達(dá)）。

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Expression of the interferon response is modulated by the tumor microenvironment

癌細(xì)胞狀態(tài)可能反映了常見(jiàn)的物理限制以及與其微環(huán)境中細(xì)胞成分的相互作用。值得注意的是，免疫療法在一系列癌癥類型中的成功表明癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間存在保守的相互作用，這讓我們質(zhì)疑與免疫系統(tǒng)的相互作用是否會(huì)影響發(fā)生的癌細(xì)胞狀態(tài)。干擾素反應(yīng)模塊尤其可能參與癌細(xì)胞和 TME 之間的相互作用。在腫瘤中，I 型干擾素由癌細(xì)胞和 DC 分泌，以響應(yīng) DNA 片段激活 cGAS/STING 通路，并導(dǎo)致 T 細(xì)胞啟動(dòng)和抗腫瘤活性。 IFNγ 主要由適應(yīng)性免疫細(xì)胞在激活時(shí)產(chǎn)生，并導(dǎo)致 MHC I 基因的上調(diào)，最初促進(jìn)腫瘤排斥，但最終通過(guò)免疫編輯導(dǎo)致 IFN 無(wú)反應(yīng)的腫瘤。根據(jù)這些觀察，我們query是否需要適應(yīng)性免疫細(xì)胞來(lái)在體內(nèi)引發(fā)癌細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)模塊。為此，使用了已建立的同種異體移植小鼠癌癥模型，其中 TME 很容易受到干擾。對(duì)四個(gè)原位胰腺腫瘤進(jìn)行了 scRNA-Seq，以驗(yàn)證基因模塊可以在原位模型中重現(xiàn)。像之前一樣使用 NMF 識(shí)別基因模塊，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)系統(tǒng)中有五個(gè)被概括：循環(huán)、應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、缺氧和腺體分化。

同時(shí)，從 Rag1-/- 小鼠中形成的四種原位腫瘤中收集了 scRNA-Seq 數(shù)據(jù)，這些腫瘤缺乏 T 和 B 細(xì)胞。分析來(lái)自這些腫瘤的惡性細(xì)胞中的基因模塊表達(dá)，發(fā)現(xiàn)循環(huán)、應(yīng)激反應(yīng)、缺氧和腺體分化在 Rag1-/- 和 WT 小鼠之間以相似的頻率表達(dá)。相比之下，干擾素反應(yīng)模塊在來(lái)自 Rag1-/- 小鼠的腫瘤中以較低頻率表達(dá)（p < 10^-10，Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)）。此外，相對(duì)于其他癌細(xì)胞，干擾素反應(yīng)模塊的所有基因在表達(dá)干擾素反應(yīng)的細(xì)胞中都被上調(diào)，這表明協(xié)調(diào)反應(yīng)得以維持——盡管細(xì)胞較少。干擾素反應(yīng)模塊的 MHC I 基因（B2m、H2-D1、H2-K1）在 Rag1-/- 小鼠中總體表達(dá)較低（盡管它們?cè)诟蓴_素反應(yīng)表達(dá)細(xì)胞中保持相對(duì)上調(diào)），表明淋巴細(xì)胞耗竭對(duì) MHC I 基因的表達(dá)具有額外的一般影響，該基因不依賴于干擾素反應(yīng).

接下來(lái)測(cè)試了不同的腫瘤微環(huán)境是否也會(huì)調(diào)節(jié)干擾素反應(yīng)模塊的表達(dá)。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將胰腺中的原位腫瘤（癌癥的起源部位）與腹膜中的異位腫瘤（常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位）進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)腹膜中的腫瘤具有較低頻率的干擾素反應(yīng)表達(dá)細(xì)胞（在 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)中 p < 10^-6）。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，比較了兩個(gè)異位部位（腹膜和肝臟）的頻率，以模擬體內(nèi)不同的轉(zhuǎn)移部位。在這里，發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊在肝臟中的表達(dá)頻率高于腹膜（p < 10^-10，Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)）。

總的來(lái)說(shuō)，這組實(shí)驗(yàn)提供了對(duì)干擾素反應(yīng)模塊在癌癥中出現(xiàn)的初步評(píng)估。該模塊在各種癌癥類型、器官和免疫環(huán)境中的存在表明，惡性細(xì)胞間干擾素反應(yīng)的異質(zhì)性是腫瘤的一個(gè)共同特征。發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對(duì)于該模塊的大部分（但不是全部）表達(dá)是必要的。淋巴細(xì)胞耗盡狀態(tài)下的剩余表達(dá)表明癌細(xì)胞中干擾素反應(yīng)的其他原因，無(wú)論是癌癥外源性，例如 NK 細(xì)胞分泌的干擾素，還是癌癥內(nèi)源性，與體外干擾素反應(yīng)模塊的報(bào)告一致。值得注意的是，這一發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有區(qū)分引發(fā)干擾素反應(yīng)的信號(hào)機(jī)制和導(dǎo)致選擇腫瘤內(nèi)狀態(tài)的長(zhǎng)期免疫編輯.

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Spatial organization of malignant and non-malignant cell types in the tumor

為了進(jìn)一步分析癌細(xì)胞狀態(tài)與 TME 細(xì)胞之間的組織和相互作用，我們轉(zhuǎn)向基于測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST)。與解離后獲得的 scRNA-Seq 不同——導(dǎo)致任何空間信息的丟失——基于陣列的 ST 數(shù)據(jù)不是以單細(xì)胞分辨率捕獲組織內(nèi)每個(gè)位置的 mRNA，而是每個(gè)點(diǎn)捕獲約 10 個(gè)細(xì)胞。因此，試圖通過(guò)整合十個(gè)腫瘤（OVCA NYU1、OVCA NYU3、UCEC NYU3、BRCA NYU0、BRCA NYU1、BRCA NYU2、PDAC NYU1、GIST NYU1、GIST NYU2、LIHC NYU1）的配對(duì)數(shù)據(jù)來(lái)利用這兩種模式的特性。我們的 10 個(gè)腫瘤 ST 數(shù)據(jù)集中的每一個(gè)都由 6mm x 6mm 區(qū)域上的約 2,000 個(gè)點(diǎn)（范圍從 1,351 到 2,624）組成。 ST 陣列上的斑點(diǎn)相隔 100μm，使我們能夠深入了解腫瘤微環(huán)境，例如，在這種距離下，旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)功能。

由于每個(gè)點(diǎn)都是一種或多種細(xì)胞類型的細(xì)胞組合，因此其轉(zhuǎn)錄組可以表示為細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄組的加權(quán)總和。為了推斷每個(gè)細(xì)胞類型在每個(gè)點(diǎn)的貢獻(xiàn)，使用來(lái)自配對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型的平均表達(dá)譜進(jìn)行了非負(fù)線性最小二乘 (NNLS) 回歸（單細(xì)胞空間聯(lián)合）。然后，將針對(duì)每種細(xì)胞類型獲得的系數(shù)與在隨機(jī)模型中獲得的系數(shù)進(jìn)行比較，如果某個(gè)細(xì)胞的系數(shù)比隨機(jī)集中的平均值高出兩個(gè)以上的標(biāo)準(zhǔn)差，則認(rèn)為該細(xì)胞存在于某個(gè)點(diǎn)。團(tuán)隊(duì)的病理學(xué)家（C.H. 和 D.F.D.）進(jìn)一步驗(yàn)證了這些注釋。作為進(jìn)一步分析的框架，我們根據(jù)細(xì)胞類型注釋將斑點(diǎn)分為三類：“惡性”，僅包含惡性細(xì)胞，“正?！?，僅包含免疫和基質(zhì)細(xì)胞，以及“兩者”，包含組合。

作為spot分類的獨(dú)立方法，還直接比較了 10 個(gè)配對(duì)數(shù)據(jù)集的spot和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。&&下圖 b 顯示了來(lái)自 OVCA NYU1 樣本的轉(zhuǎn)錄組的降維圖，灰色點(diǎn)表示 ST 點(diǎn)，其他顏色表示單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，由注釋的細(xì)胞類型著色。通過(guò)調(diào)用相互最近鄰 (MNN) 集成和聯(lián)合降維，發(fā)現(xiàn)來(lái)自兩種模態(tài)的數(shù)據(jù)很好地集成在一起。單個(gè)細(xì)胞在外圍形成cluster，表明不同的細(xì)胞類型。 ST 點(diǎn)要么與單個(gè)單細(xì)胞cluster混合，表示純種群，要么連接多個(gè)cluster，表示細(xì)胞類型的組合。將 NNLS 方法確定的spot類別疊加到該圖上，始終觀察到“惡性”斑點(diǎn)與惡性細(xì)胞cluster混合，“正?！眘pot位于非惡性細(xì)胞類型區(qū)域，“兩個(gè)”斑點(diǎn)跨越惡性和非惡性單細(xì)胞cluster。作為第二個(gè)例子，LIHC ST 數(shù)據(jù)集顯示了兩個(gè)空間不同的腫瘤結(jié)節(jié)，左側(cè)有大量惡性和非惡性細(xì)胞混合，右側(cè)幾乎僅由惡性細(xì)胞組成。聯(lián)合降維分析反映了兩個(gè)對(duì)應(yīng)的惡性cluster，在單獨(dú)考慮單細(xì)胞降維時(shí)沒(méi)有區(qū)別。該分析強(qiáng)調(diào)了整合成對(duì)的空間和單細(xì)胞數(shù)據(jù)集以將單個(gè)細(xì)胞錨定在其空間環(huán)境中的潛力。

為了進(jìn)一步測(cè)試 NNLS 方法注釋斑點(diǎn)的準(zhǔn)確性，對(duì)兩個(gè)源自患者的黑色素瘤異種移植物 (PDX) 進(jìn)行了配對(duì)的 scRNA-Seq 和 ST。在這種情況下，只有惡性細(xì)胞來(lái)自人類，因此表達(dá)人類基因，使我們能夠可靠地識(shí)別惡性細(xì)胞或斑點(diǎn)。在完整的小鼠和人類轉(zhuǎn)錄組上使用 NNLS 方法，我們首先為點(diǎn)身份建立了“基本事實(shí)”。然后我們通過(guò)將小鼠基因轉(zhuǎn)換為人類直向同源物來(lái)模擬患者樣本，從而去除物種信息。以這種方式使用 NNLS 注釋斑點(diǎn)導(dǎo)致每個(gè)樣本的特異性分別為 99% 和 89%，支持其準(zhǔn)確性。

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Cancer cell state analysis of tumor cellular neighborhoods（空間臨近分析）

確定了每個(gè)腫瘤內(nèi)的惡性和非惡性細(xì)胞類型后，接下來(lái)試圖根據(jù)癌細(xì)胞狀態(tài)query細(xì)胞鄰域的組成。為此，繪制了每個(gè) ST 樣本中的癌細(xì)胞狀態(tài)，對(duì)每個(gè)“惡性”點(diǎn)的每個(gè)模塊的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。為了確定這種評(píng)分方法的有效性，首先再次轉(zhuǎn)向 PDX 數(shù)據(jù)并對(duì)模塊表達(dá)的“惡性”點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分。由于在該系統(tǒng)中可以明確地區(qū)分人類惡性細(xì)胞與小鼠 TME 細(xì)胞，我們首先使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)來(lái)確認(rèn)模塊是由惡性細(xì)胞本身差異表達(dá)的，并排除了由 TME 污染引起的偽影的可能性。例如，pEMT 模塊包括通常由成纖維細(xì)胞表達(dá)的基因，但我們?cè)趷盒约?xì)胞中檢測(cè)到它的存在。正如預(yù)期的那樣，干擾素反應(yīng)模塊不存在，因?yàn)榕c Rag-/- 小鼠一樣，這些小鼠缺乏淋巴細(xì)胞。

為了表征每個(gè)“惡性”點(diǎn)周圍的細(xì)胞類型組成，計(jì)算了每種細(xì)胞類型的兩個(gè)分?jǐn)?shù)指數(shù)，旨在捕捉它們的微環(huán)境。將“鄰域分?jǐn)?shù)”定義為包含該細(xì)胞類型的周圍斑點(diǎn)的分?jǐn)?shù)。因此，該分?jǐn)?shù)直接測(cè)量相鄰點(diǎn)中的細(xì)胞類型組成。鄰近度得分衡量感興趣點(diǎn)與每種細(xì)胞類型的接近程度，并計(jì)算為到該類型細(xì)胞的最短距離的倒數(shù)。

將每個(gè)腫瘤“惡性”點(diǎn)的模塊評(píng)分和細(xì)胞類型鄰域特征相關(guān)聯(lián)，揭示了 TME 的癌細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型如何共同定位以形成“鄰域”。更密切地研究這種相關(guān)性證實(shí)了模塊評(píng)分和巨噬細(xì)胞鄰域評(píng)分之間這種正相關(guān)關(guān)系的重要性。在使用接近度評(píng)分計(jì)算巨噬細(xì)胞的存在時(shí)，也觀察到了一致的關(guān)系。為了探索所有樣本之間的這種關(guān)系，我們計(jì)算了巨噬細(xì)胞鄰域的相關(guān)分?jǐn)?shù)（±log10（p 值））。與干擾素反應(yīng)的相關(guān)性在所有樣品中均呈正相關(guān)，10 個(gè)樣品中有 8 個(gè)顯著。任何其他模塊都不是這種情況。這表明巨噬細(xì)胞可能會(huì)引發(fā)干擾素反應(yīng)模塊的表達(dá)，或者表達(dá)干擾素反應(yīng)的癌細(xì)胞可能會(huì)募集巨噬細(xì)胞。事實(shí)上，最近的一項(xiàng)研究表明，刺激腫瘤中的干擾素反應(yīng)途徑會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的募集和激活。

使用鄰域和鄰近度量擴(kuò)展對(duì)所有細(xì)胞類型和模塊對(duì)的分析，確定了細(xì)胞狀態(tài)與 TME 細(xì)胞類型的其他一致共定位。除了巨噬細(xì)胞外，根據(jù)這兩種方法，表達(dá)干擾素反應(yīng)的癌細(xì)胞與 T 細(xì)胞共定位，這與淋巴細(xì)胞導(dǎo)致干擾素反應(yīng)增加的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一致。需要進(jìn)一步的工作來(lái)確定這些相互作用的模式和方向。進(jìn)行EMT的癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞呈正相關(guān)，與其他惡性細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，與在腫瘤界面富集并與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞相互作用的發(fā)現(xiàn)一致。