原理

新型冠狀病毒的N蛋白、E蛋白和S蛋白等抗原，可作為免疫原，在病毒感染人體后，刺激漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。依據(jù)雙抗夾心ELISA原理，樣本滴加在樣本墊上，通過液相層析依次通過結(jié)合墊，NC膜上的檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。結(jié)合墊內(nèi)含有標(biāo)記的抗原特異性抗體，可以與樣本中的抗原（病毒蛋白）發(fā)生結(jié)合，當(dāng)液流到達(dá)檢測線（T線）時，固定在這條線上的第二種抗原特異性抗體再次與抗原結(jié)合，將會呈現(xiàn)陽性結(jié)果。質(zhì)控線（C線）包被IgG抗體，可以結(jié)合樣本墊中抗體，用于判斷層析過程是否順利。

image.png

image.png

image.png

三種方法

熒光免疫層析法

熒光免疫層析技術(shù)是基于[抗原抗體]特異性[免疫反應(yīng)]的新型膜檢測技術(shù)。該技術(shù)以固定有檢測線(包被抗體或包被抗原)和質(zhì)控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為[固定相]，測試液為[流動相]，熒光標(biāo)記抗體或抗原固定于連接墊，通過毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動。對于帶有多個[抗原決定簇]的大分子抗原([蛋白]、[病毒]、[致病菌]等)，通常采用“三明治”型雙抗夾心免疫層析方法，即待測物在流動相作用下先與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測線時再與包被抗體結(jié)合形成雙抗夾心的“三明治”型。

• 應(yīng)用
  多用于食品質(zhì)量安全快速檢測分析研究。

• 標(biāo)記物

（1）熒光素
（2）量子點(diǎn)

image.png

（3）上轉(zhuǎn)換納米粒子

膠體金法

膠體金法是由氯金酸(HAuCl4)在[還原劑]如[白磷]、[抗壞血酸]、[枸櫞酸鈉]、[鞣酸]等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于[靜電作用]成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金也是[免疫電鏡技術(shù)]中較為理想的免疫標(biāo)記物。

• 基本原理
  膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的[正電荷][基團(tuán)]形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。 膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它[生物大分子]結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高[電子密度]、顆粒大小、形狀及[顏色反應(yīng)]，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、[組織學(xué)]、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。 膠體[金標(biāo)]記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從[氯金酸]制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與[葡萄球菌A蛋白]、[免疫球蛋白]、毒素、[糖蛋白]、酶、抗生素、激素、[牛血清白蛋白]多肽綴合物等非共價結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。 免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling technique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些[標(biāo)記物]在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或[半定量]的快速免疫檢測方法中，這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。
• 制備方法
  用容量瓶量取200ml超純水加入到 500ml錐形瓶中，將錐形瓶置于[磁力加熱攪拌器]加熱板上，放入磁力攪拌子，打開攪拌旋鈕至適當(dāng)速度。用移液器吸取2ml 1%氯金酸溶液于上述 200ml超純水中，攪拌1min，關(guān)閉攪拌旋鈕，打開加熱旋鈕，加熱至沸騰。打開攪拌旋鈕至適當(dāng)速度，快速加入經(jīng)[微孔濾膜]過濾。1% 檸檬酸三鈉溶液0.8ml，溶液在2分鐘內(nèi)由灰色變黑色最后變?yōu)榧t色，再繼續(xù)加熱攪拌 10分鐘。關(guān)掉加熱旋鈕，適當(dāng)速度攪拌至室溫，定容至200ml，4℃保存。
• 應(yīng)用
  （1）免疫膠體金光鏡染色法 細(xì)胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。
  （2）免疫膠體金電鏡染色法 可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。 斑點(diǎn)免疫金滲濾法
  （3）應(yīng)用微孔濾膜（如膜）作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體。
  （4）膠體金免疫層析法 將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。

乳膠法

乳膠凝集法( Latex agglutination test，LAT) 是以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗(yàn)。即吸附可溶性抗原于其表面，特異性抗體與之結(jié)合后，可產(chǎn)生凝集反應(yīng)。這種方法具有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn): 不需要特殊儀器、肉眼判斷、操作簡便、不需要專門培訓(xùn)；檢測時間短，一般為 2 min；價格低廉，檢測單份血清樣品的成本比其它血清學(xué)和病原學(xué)方法低得多；適于現(xiàn)場檢測等，在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。

• 原理
  普通聚苯乙烯乳膠和抗體的結(jié)合是無選擇性的物理靜電吸附，抗體很難結(jié)合到乳膠表面，即使致敏上的抗體也容易從乳膠微球上脫落或者變性失活，而使用多肽縮合劑或交聯(lián)劑則操作過程繁瑣、耗時。
  研究以帶有磺酸基的三元聚合物乳膠微球?yàn)檩d體,獲得單分散性好的乳膠，通過調(diào)節(jié) p H 值后乳膠微球表面帶有較多的電荷，易吸附抗體。將單克隆抗體吸附到乳膠表面，制備乳膠抗體復(fù)合物診斷試劑。這種方法克服了普通乳膠致敏抗體的缺點(diǎn)，不需使用交聯(lián)劑，提高了抗體的結(jié)合效率，而且致敏上的抗體不容易從乳膠上脫落，進(jìn)而提高乳膠的敏感性和保質(zhì)期，適合產(chǎn)品開發(fā)和大規(guī)模生產(chǎn)的要求。
• 應(yīng)用

1. 乳膠凝集法可用于豬圓環(huán)病毒的快速檢測
2. 快速檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）
3. 檢測麻疹病毒Ig-M抗體也有較好應(yīng)用