1973年，美國BD公司和美國斯坦福大學(xué)合作，研發(fā)生產(chǎn)了其第一臺商用流式細胞儀FACS I；20世紀(jì)80年代初期，最早的三色流式細胞儀出現(xiàn)，使流式細胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大；到了20世紀(jì)90年代中期，出現(xiàn)了四色流式，流式細胞儀逐漸從科研單位進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科，廣泛應(yīng)用于患者的免疫分型、微小殘留檢測等檢測，成為現(xiàn)代化臨床檢驗儀器的一部分。
常見流式細胞儀：本文僅介紹分析型
1. 基本介紹
1.1 上樣需求與信息獲取
流式細胞術(shù)：在流動狀態(tài)下，同時檢測單個細胞的特性（特異、靈敏、多參數(shù)同時分析）
樣本種類：各種細胞，微生物，人工合成微球，其他（血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液）
上樣要求：濃度（5 x 10 ^5 ~ 1 x 10 ^7 cells/ml），體積 0.5 -1 ml，300目篩網(wǎng)過濾
物理信息：微粒大小，微粒結(jié)構(gòu)
抗原表達信息：表面抗原、胞內(nèi)抗原、核內(nèi)抗原
其他：核酸、分泌蛋白、細胞因子
1.2 常見的應(yīng)用領(lǐng)域
2021年基于我國流式用戶分布，58%的用戶為科研單位，占比第二的為醫(yī)院36.45%。
1.2.1 科研領(lǐng)域
細胞周期分析：在細胞周期的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，對細胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M。
細胞凋亡分析：正常的細胞膜結(jié)構(gòu)為磷脂雙分子層，磷脂酰絲氨酸（藍綠色小球）位于細胞內(nèi)膜，細胞發(fā)生凋亡后，磷脂酰絲氨酸（藍綠色小球）發(fā)生外翻，通過熒光染料PE標(biāo)記的Annexin V蛋白與磷脂酰絲氨酸在鈣離子存在的條件下結(jié)合，聯(lián)合PI篩選凋亡細胞（死細胞具有膜通透性，顯示PE和PI雙陽性）
細胞增殖能力檢測：利用染料CFSE通過DMSO擴散到細胞內(nèi)，可以與蛋白質(zhì)的胺基發(fā)生偶聯(lián)（標(biāo)記上藍色的熒光），細胞有絲分裂時被染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)也會被一分為二，增殖的代數(shù)越多熒光強度越弱（表現(xiàn)為成倍的降低）
胞外-細胞因子檢測： 細胞因子較多時可以選用CBA的方法（小于2種推薦ELISA），收集含有細胞因子的上清與標(biāo)記有不同細胞因子一抗的不同熒光強度的beads孵育（beads熒光強度區(qū)分不同細胞因子），然后再與攜帶熒光素的二抗孵育，流式分析圖中可以看到：縱軸-beads熒光強弱-表示不同細胞因子；橫軸-二抗熒光強度-表示對應(yīng)細胞因子的濃度
胞內(nèi)-細胞因子檢測： 首先抑制胞內(nèi)蛋白分泌，然后做細胞膜打孔，使得熒光素標(biāo)記的抗體進入胞內(nèi)（固定破膜：便是使胞漿不具有流動性后在細胞膜上打孔），與細胞因子結(jié)合后通過流式檢測。
檢測淋巴細胞亞群：監(jiān)測細胞免疫狀態(tài)(淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)功能重要的大細胞群，在免疫應(yīng)答過程中，末梢血淋巴細胞發(fā)育分化成為功能不同的亞群。當(dāng)亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，就能導(dǎo)致機體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化
1.2.2 臨床領(lǐng)域
以白血病為例，從 初篩階段 開始，基于流式細胞術(shù)的異常淋巴細胞亞群及絕對計數(shù)結(jié)果能夠給與臨床初步判斷信息；在 診療階段，更為明確的白血病分型及MRD監(jiān)測有助于為治療方案選擇、臨床療效分析、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面提供更加精準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)決策支持，而在 免疫重建過程中，多參數(shù)流式細胞術(shù)結(jié)果對于及時評價患者的細胞免疫功能，指導(dǎo)免疫抑制劑等藥品的使用種類和劑量等方面均具有重要價值。
臨床檢測都有標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方案，可以直接上機調(diào)用建立好的內(nèi)置模板，使用比較方便
1.2.3 工業(yè)領(lǐng)域
細胞免疫治療，藥物開發(fā)，細胞技術(shù)開發(fā)
2. 流式細胞儀組成和工作原理
傳統(tǒng)的分析型流式細胞儀主要由以下三大系統(tǒng)組成：液流系統(tǒng)，光學(xué)系統(tǒng)，電子系統(tǒng)。
2.1 液流系統(tǒng)
液流系統(tǒng)： 也就是液流的驅(qū)動系統(tǒng)，主要提供動力。我們的樣本在壓力的作用下由鞘液包裹著單細胞流經(jīng)流動池。
鞘液 是無熒光本底的平衡電解質(zhì)溶液，主要成份為氯化鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸二鈉和抑菌劑，它作為庫爾特流式細胞儀對細胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性進行分析時的鞘液使用。
液流系統(tǒng)的核心元件為 流動室，細胞在流動室內(nèi)是一個個排列檢測的，細胞和激光器處于一個正交狀態(tài)，檢測會更準(zhǔn)確。
- 如果有氣泡：細胞核激光不會呈現(xiàn)正交狀態(tài)，CV值變大
- 如果有雜質(zhì)：對激光進行反射
- 上樣時避免樣本走空，進入大量空氣使激光照射流動室灼傷元件
2.2 光學(xué)系統(tǒng)
單細胞懸液在流動池中經(jīng)過激光器的激發(fā)（細胞樣本攜帶有熒光染料），熒光染料經(jīng)過激光器的激發(fā)發(fā)出不同波長的激發(fā)光，經(jīng)過接收系統(tǒng)接收。
2.2.1 散射光信號
- 前向角散射光（Forward Scatter, FSC）：提供細胞“相對大小”信息。
- 側(cè)向角散射光（Side Scatter, SSC）：提供細胞 “顆粒度” 信息（細胞復(fù)雜程度）
下圖為人外周全血細胞（紅細胞溶解后）的分群圖：FSC表示細胞相對大小，SSC表示細胞相對復(fù)雜程度，紫色的細胞群代表結(jié)構(gòu)復(fù)雜且體積相對最大的中性粒細胞，綠色的細胞群代表同樣體積較大但結(jié)構(gòu)稍簡單的單核細胞，而左下角黑色的小點點為雜質(zhì)或細胞碎片
2.2.2 熒光信號
檢測原理：使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色（做多色分析），熒光信號強弱反映了細胞抗原的表達含量
舉例：流式雙參數(shù)散點圖（CD3-CD19- CD3+CD19- CD3-CD19+）CD3 FICT CD19 APC 一般都用CD3定位T淋巴細胞
選擇熒光素抗體需要了解 熒光素特征光譜，以適配儀器
- 關(guān)注儀器的激發(fā)光波長：通常在激發(fā)光譜的波峰位置（達到最大的激發(fā)效率）
- 關(guān)注儀器的探測器（濾光片+PMT）：發(fā)射光譜的波峰位置盡量在濾光片能接收波長的范圍內(nèi)（達到最大的接收效率）
實際應(yīng)用中，儀器搭配3種濾光片來使用：longpass(LP)、shortpass(SP)、bandpass(BP)，它們置于熒光探測器前，限定其接收的熒光波長的范圍，從而將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集。
- LP 500：波長大于500nm的光可通過
- SP 500：波長小于500nm的光可通過
- BP 500/50：波長在500±25nm的光可通過
2.3 電子系統(tǒng)
功能：將光信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號
2.3.1 流式圖如何形成
細胞進行檢測的時候都是單細胞級別（一個個得獲得細胞體積信息和表面蛋白信息），因此每個細胞在后續(xù)檢測通道都會形成一個獨特的數(shù)值，類似于單細胞測序的表達矩陣（不過信息量要小很多）。
舉例：相似的細胞具有相同的PE和FITC值，因而在圖片上有相似的落點，相似的落點集合在一起便形成了圖片上我們看到的聚集群
2.3.2 流式圖如何選取
傳統(tǒng)流式細胞術(shù)都是用直方圖、二維散點圖或等高線圖三種形式展現(xiàn)，其中等高線圖更多得用于輔助圈門
3. 操作注意事項
精確的分析結(jié)果需要搭配合理的流式對照，排除 自發(fā)熒光 和 非特異性熒光 的干擾
特異性結(jié)合： 抗體Fab段與抗原的結(jié)合
非特異性結(jié)合：抗體Fc段與抗原的結(jié)合
流式對照的意義：去除非特異熒光和自發(fā)熒光
3.1 陰性對照（Isotype control，設(shè)定實驗檢測條件）
陰性對照的作用 主要在于設(shè)定實驗檢測條件，如調(diào)節(jié)散射光電壓（看到細胞群體）、設(shè)定閾值（看到觀測范圍）、調(diào)整熒光電壓（確定陰性細胞位置）。目前有兩種方式：
- 空白對照：樣本（單細胞懸液）不做抗體標(biāo)記跑流式分析，去除自發(fā)熒光的干擾
- 同型對照：樣本（單細胞懸液）用 “同型對照抗體” 孵育后跑流式分析，去除自發(fā)熒光+非特異熒光的干擾
同型對照抗體設(shè)置原則：（1）相同種屬來源；（2）相同免疫球蛋白及亞型；（3）相同熒光素標(biāo)記；（4）相同劑量和濃度；（5）由未免疫動物血清純化而來
舉例：BD的同型對照抗體
3.2 單陽性對照（調(diào)節(jié)熒光補償）
3.2.1 熒光補償-定義
熒光補償（colour compensation）：在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectral overlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。
3.2.2 熒光補償-實驗設(shè)計
在雙色或多色分析中，都要消除熒光素發(fā)射光譜重疊的干擾
- 明確已知的單陽管樣本
- 使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進行染色
- N色分析需要制備N個單陽對照管
舉例FITC-PE雙染熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)：
- 第一步：陰性對照調(diào)節(jié)電壓確定陰陽性界限
- 第二步：通過FITC單陽對照管-調(diào)整圖 “橫平”
- 第三步：通過PE單陽對照管-調(diào)整圖 “豎直”
補償模型：FITC-PE雙染舉例
補償原則：陰性median值與對應(yīng)的單陽性對照median值大小相似
補償原則：陰性median值與對應(yīng)的單陽性對照median值大小相似
