Cell Res | 腫瘤抗原特異性T細胞增強個性化TCR-T細胞治療和預(yù)測免疫治療反應(yīng)

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?

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撰文：huacishu

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1、利用scRNA-seq、TCR-seq和體外新抗原刺激，作者揭示了腫瘤中Tas細胞的特征。有幾種標記物被鑒定出能特異性區(qū)分腫瘤中的CD4+和CD8+Tas細胞；

2、進一步研究表明，用Tas-TCR工程的T細胞對自體PDX腫瘤具有顯著的治療效果。經(jīng)鑒定的表面生物標記物能夠通過FACS分選從腫瘤中分離Tas細胞。

中山大學(xué)周鵬輝教授課題組在國際知名期刊Cell Res在線發(fā)表題為“Defined tumor antigen-specific T cells potentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of immunotherapy response”的論文。針對腫瘤特異性抗原（TSA）的個性化免疫治療可以在不損害正常組織的情況下產(chǎn)生高效、安全的抗腫瘤免疫反應(yīng)。盡管新抗原疫苗已在臨床試驗中顯示出治療效果，但從腫瘤突變中準確預(yù)測新抗原仍然具有挑戰(zhàn)性。宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)選擇并激活識別腫瘤抗原的T細胞。因此，從患者體內(nèi)自然產(chǎn)生的腫瘤抗原特異性T（Tas）細胞中獲得T細胞受體（TCR）的T細胞將靶向其腫瘤中的TSA。為了建立這種個性化的TCR-T細胞療法，作者通過單細胞mRNA測序（scRNA-seq）、TCR測序（TCR-seq）和體外新抗原刺激對腫瘤及其鄰近組織中的T細胞進行了綜合表征。與組織間循環(huán)的旁觀者T細胞相比，Tas細胞具有腫瘤富集、腫瘤特異性克隆擴增和新抗原特異性的特點。發(fā)現(xiàn)CXCL13是CD4+和CD8+Tas細胞的獨特標記物。重要的是，從Tas細胞表達TCR的TCR-T細胞對自體患者源性異種移植（PDX）腫瘤顯示出顯著的治療效果。通過CXCL13表達測定的腫瘤內(nèi)Tas細胞水平準確預(yù)測了對免疫檢查點阻斷的反應(yīng)，表明Tas細胞在抗腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用。進一步將CD200和ENTPD1分別鑒定為CD4+和CD8+Tas細胞的表面標記物，這使得通過熒光激活細胞分選儀（FACS）從腫瘤中分離Tas細胞成為可能?？偟膩碚f，作者的結(jié)果表明，用Tas-TCR基因工程的TCR-T細胞是一種有前途的個體化免疫治療劑，腫瘤內(nèi)Tas細胞水平?jīng)Q定了免疫治療的反應(yīng)。

作者建立了一個體外腫瘤抗原刺激系統(tǒng)，以研究測序T細胞TCR的抗原特異性（圖1a）。簡而言之，構(gòu)建TCR序列并將其從外周血單個核細胞（PBMC）導(dǎo)入T細胞，以建立TCR-T細胞。通過腫瘤和腫瘤周圍組織的全外顯子測序（WES）和大量RNA測序（RNA-seq）鑒定來自腫瘤突變的有效新抗原表位。以自體B細胞經(jīng)EB病毒（EBV）感染轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞樣細胞作為抗原呈遞細胞（APC）。體外腫瘤抗原刺激是通過將TCR-T細胞與由腫瘤特異性突變序列組成的串聯(lián)微基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的APC共培養(yǎng)來實現(xiàn)的。通過產(chǎn)生γ干擾素（IFNγ）來評估受試TCR的反應(yīng)。同時，將測序患者的腫瘤移植到免疫缺陷的小鼠中，以建立用于TCR-T細胞治療實驗的PDX模型。對擴增的CD4+和CD8+T細胞進行了單獨的聚類分析，并通過特定的基因表達特征識別了10個CD4和9個CD8簇（圖1b）。T細胞亞型的經(jīng)典標記物表明CD4+和CD8+T細胞以及CD4+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）中存在傳統(tǒng)的效應(yīng)、記憶、衰竭簇（圖1c）。在CD4+和CD8+T細胞中發(fā)現(xiàn)了兩個具有活躍的有絲分裂的簇（CD4_C10_MKI67和CD8_C9_MKI67），其特征是MKI67、TK1和STMN1的高表達。在以前的研究中也有類似的聚類報告。為了找到腫瘤中富集的T細胞群，檢查了每個簇的組織分布（圖1d，f）。與之前的報道一致，血液和組織中的T細胞被分成不同的簇。兩個CD4（CD4_C1_LEF1和CD4_C2_PRF1）和兩個CD8簇（CD8_C1_LTB和CD8_C2_CX3CR1）主要包含血液中的T細胞，而其他簇幾乎完全位于其他三個組織中。腫瘤周圍和正常組織共享記憶和效應(yīng)簇，但在腫瘤中觀察較少，除了GZMK高表達的記憶簇（CD4_C3_GZMK和CD8_C3_GZMK）在所有三種組織中擴散（圖1d，f）。衰竭的簇（CD4_C9_CXCL13和CD8_C8_CXCL13）、CD4+Tregs（CD4_C8_FOXP3）和有絲分裂活躍的簇（CD4_C9_MKI67和CD8_C9_MKI67）在腫瘤中富集。CD4_C9_MKI67簇也出現(xiàn)在正常組織中（圖1d，f）。每個簇的組織分布也通過比較觀察到的和預(yù)期的每個簇的細胞數(shù)得到證實（圖1e，g）。有趣的是，衰竭標記物（HAVCR2、CTLA4、TIGIT、LAG3和TOX）的高表達并不局限于兩個衰竭簇；CD4+Tregs和具有活躍有絲分裂的CD8簇顯示出這些基因的相似表達水平（圖1c）。在有絲分裂活躍的CD4簇中也觀察到中等水平的耗竭基因。這些發(fā)現(xiàn)揭示了腫瘤富集簇中基因表達的耗盡特征，表明這些簇中的T細胞經(jīng)歷了抗原刺激。

作者比較了腫瘤TCR在腫瘤及其鄰近組織中的分布。觀察到組織共有的和腫瘤特異性TCR（圖2a），表明循環(huán)和局部擴張共同促進了腫瘤中的T細胞組成?？偟膩碚f，CD8+T細胞在腫瘤中的克隆頻率高于CD4+T細胞（圖2a），表明這些患者的腫瘤抗原主要由MHC I類分子呈現(xiàn)。為了確定哪些簇保留了在腫瘤中特異性擴增的T細胞克隆，作者選擇了每個簇中腫瘤T細胞的前10個TCR，并比較了它們在腫瘤及其鄰近組織中的分布。這四個血液特異性簇沒有被分析，因為它們含有極少的腫瘤T細胞。在富含腫瘤的簇（CD4+T細胞中的C9、C10和CD8+T細胞中的C8、C9）中觀察到腫瘤特異性TCR擴增，但在其他簇中未觀察到（圖2b）。這些結(jié)果表明，腫瘤富集簇中的T細胞被腫瘤抗原擴增。如圖2c所示，具有腫瘤特異性TCR擴增的簇（CD4+T細胞中的C9、C10和CD8+T細胞中的C8、C9）的比例與TMB顯著正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)支持TCR在腫瘤富集簇中的擴增主要由腫瘤突變衍生的新抗原的刺激介導(dǎo)。

為了確定含有腫瘤中特異性擴增的TCR的T細胞的生物標記物，將具有腫瘤特異性TCR的T細胞的基因表達與腫瘤CD4+或CD8+T細胞中具有組織共享TCR的T細胞進行比較。CD4+Treg細胞也與組織共有TCR的CD4+T細胞進行比較。在這些T細胞群中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達基因（圖3a）。有趣的是，CXCL13在具有腫瘤特異性TCR的CD4+和CD8+T細胞中特異性表達（圖3b）。作者進一步檢查了每個T細胞簇中CXCL13的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤富集簇（CD4+T細胞中的C9、C10和CD8+T細胞中的C8、C9）表達高水平的CXCL13（圖3c）。然后，在CXCL13+T細胞中觀察到腫瘤特異性TCR擴增（圖3d）。作者還比較了CD4+CXCL13+、CD4+CXCL13?中四種類型TCR（1α1β、1α2β、2α1β和2α2β）的頻率, CD8+CXCL13+和CD8+CXCL13?對10名測序患者的T細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)CXCL13+和CXCL13?之間的頻率在統(tǒng)計學(xué)上并不顯著。此外，在10例測序的非小細胞肺癌（NSCLC）患者中，CXCL13+細胞在總腫瘤T細胞中的百分比與TMB呈正相關(guān)（圖3e）。對來自癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫的腫瘤RNA-seq數(shù)據(jù)的分析還顯示，CXCL13和TMB在多種癌癥類型中的中位表達之間存在顯著相關(guān)性（圖3f）。這些數(shù)據(jù)表明，CXCL13是腫瘤中特異性擴增的T細胞的獨特標記物。

然后，將每個TCR-T細胞系分別與串聯(lián)基因?qū)氲幕旌狭馨湍讣毎?LCL)共同培養(yǎng)。TCR-T細胞與未經(jīng)誘導(dǎo)的LCL共培養(yǎng)作為對照。通過細胞內(nèi)染色測定TCR-T細胞中IFNγ的產(chǎn)生，以評估對抗原刺激的反應(yīng)（圖4a）。TCR-T細胞產(chǎn)生的IFNγ至少是對照組的3倍，被確定為陽性反應(yīng)。在P4患者中，一個CD4+和四個CD8+腫瘤特異性TCR對腫瘤抗原刺激呈陽性反應(yīng)，但在腫瘤共有的TCR中未檢測到陽性反應(yīng)（圖4b）。在P5患者中，一個CD4+和所有CD8+腫瘤特異性TCR對腫瘤抗原刺激呈陽性反應(yīng)，但所有腫瘤共有的TCR均未顯示陽性反應(yīng)（圖4c）。這些數(shù)據(jù)提供了直接證據(jù)，證明TCR在腫瘤中特異性擴增并識別腫瘤抗原。來自P4患者的一個CD8+腫瘤特異性TCR和兩名患者中的大多數(shù)CD4+腫瘤特異性TCR對腫瘤抗原刺激呈陰性，這可能是因為他們識別了未包含在分析中的TAA或腫瘤突變。CD4+腫瘤特異性TCR的低頻率也表明相應(yīng)的腫瘤抗原在腫瘤中的表達水平相對較低。綜合這些數(shù)據(jù)，得出結(jié)論，腫瘤中的CXCL13+T細胞是Tas細胞。接下來，使用來自P4或P5患者的腫瘤樣本在NSG小鼠中建立PDX腫瘤。通過過繼轉(zhuǎn)移分別由來自CD4+CXCL13+、CD4+CXCL13+和CD4+CXCL13?,CD8+CXCL13+和CD8+CXCL13??的前3個TCR構(gòu)建的T細胞來治療PDX腫瘤每個患者腫瘤中的T細胞。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞作為對照。表達CD8+CXCL13+T細胞TCR的TCR-T細胞對來自P4（圖4d）或P5患者（圖4e）的自體PDX腫瘤顯示出顯著的治療效果。對于用來自CD4+CXCL13+T細胞的TCR-T細胞，只有TCR對體外新抗原刺激呈陽性反應(yīng)，顯示出治療效果。使用從CXCL13獲得的TCR工程化T細胞進行治療，未觀察到任何治療效果（圖4d，e）。這些數(shù)據(jù)表明，用Tas-TCRs工程的TCR-T細胞可以有效治療自體腫瘤。

由于Tas細胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，通過CXCL13表達測定的腫瘤中這些細胞的水平可以預(yù)測對ICB的反應(yīng)。從報告的臨床試驗中收集了不同癌癥類型中ICB的客觀緩解率（ORR），并發(fā)現(xiàn)CXCL13的中位表達與多種癌癥類型中的ORR顯著相關(guān)（圖5a）。對ICB治療前已發(fā)表的腫瘤樣本RNA-seq數(shù)據(jù)的分析也表明，CXCL13的高表達與總體生存率的提高（圖5b）和對ICB的更好反應(yīng)（圖5c）相關(guān)。進一步使用免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測癌癥切片上CXCL13的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)CXCL13在CD4+和CD8+T細胞中特異表達（圖5d）。與之前的報道一致，腫瘤中的三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）顯示CXCL13的高表達，表明Tas細胞富含TLS。但在一些沒有TLS的腫瘤中也觀察到CXCL13的零星表達（圖5d）。然后，在ICB治療前收集黑色素瘤和結(jié)直腸癌（CRC）患者的腫瘤樣本，并通過IHC檢測CXCL13的表達。與已發(fā)表數(shù)據(jù)集的結(jié)果類似，這些患者中CXCL13蛋白的高水平與無進展生存率（PFS）的改善有關(guān)（圖5e）。這些數(shù)據(jù)表明，代表腫瘤中Tas細胞豐度的CXCL13水平可以準確預(yù)測對ICB的反應(yīng)。

表面標記物有助于從腫瘤中分離Tas細胞。因此，挑選了在CD4+或CD8+Tas細胞中高度表達的表面基因（圖3b），并比較了它們在腫瘤T細胞簇中的表達（圖6a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD200在CD4+CXCL13+Tas細胞中特異性表達，盡管在CD4+Treg中表達，但ENTPD1和LAYN可以區(qū)分CD8+CXCL13+Tas細胞與其他CD8簇。已發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析表明，CD4+CXCL13+和CD8+CXCL13+Tas細胞在所有9種分析的腫瘤類型中具有相似的特征（圖6b），這表明這些標記物可以識別不同腫瘤類型的Tas細胞。然后，通過流式細胞術(shù)檢測CD200和ENTPD1是否可以用于從腫瘤樣本中分離CD4+和CD8+Tas細胞。LAYN沒有接受檢測，因為沒有商用抗體。從患者腫瘤中分離出不同的免疫細胞亞群，并通過qPCR評估這些亞群中CXCL13的表達（圖6c）。與scRNA-seq數(shù)據(jù)一致，CD4+CD200+和CD8+ENTPD1+T細胞的CXCL13表達明顯高于相應(yīng)的陰性T細胞（圖6c）。此外，自體腫瘤細胞可以在體外激活CD4+CD200+和CD8+ENTPD1+T細胞（圖6d）。這些數(shù)據(jù)表明，表面標記物CD200和ENTPD1能夠分別通過FACS分選從腫瘤中分離CD4+和CD8+Tas細胞。

總之，利用scRNA-seq、TCR-seq和體外新抗原刺激，作者揭示了腫瘤中Tas細胞的特征。有幾種標記物被鑒定出能特異性區(qū)分腫瘤中的CD4+和CD8+Tas細胞。進一步表明，用Tas-TCR工程的T細胞對自體PDX腫瘤具有顯著的治療效果。經(jīng)鑒定的表面生物標記物能夠通過FACS分選從腫瘤中分離Tas細胞。因此，作者開發(fā)了一種針對個性化TSA的TCR-T細胞療法?？偟膩碚f，Tas細胞及其特異性生物標記物的鑒定為針對患者特異性腫瘤抗原的個性化TCR-T細胞治療鋪平了道路?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作者啟動了一項個性化TCR-T細胞治療實體瘤的臨床試驗。這種個體化的T細胞治療策略可以通過增強患者體內(nèi)自然產(chǎn)生的抗腫瘤免疫，產(chǎn)生高效、安全的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并為對現(xiàn)有免疫療法產(chǎn)生耐藥性的患者提供一種選擇。

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教授介紹

?周鵬輝教授2008年畢業(yè)于美國密西根大學(xué)（University of Michigan），獲得免疫學(xué)博士，隨后在哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院?(Harvard Medical School）進行博士后研究，2014年入選中山大學(xué)“百人計劃二期”青年杰出人才?，F(xiàn)為中山大學(xué)腫瘤防治中心，華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室教授、博士生導(dǎo)師。周鵬輝教授長期從事“腫瘤免疫學(xué)和腫瘤免疫治療”研究。主要以覆蓋全基因組的系統(tǒng)生物學(xué)方法，對腫瘤和免疫系統(tǒng)的互作進行系統(tǒng)性研究，鑒定新的治療靶標，建立高效的腫瘤免疫治療新方法，并研究其機理。研究成果發(fā)表于Nature，Proceedings of the National Academy of Sciences，Clinical Cancer Research等重要國際期刊。其中獨創(chuàng)的高通量免疫治療標靶篩選方法以Article形式發(fā)表于Nature (2014 Feb 6;506(7486):52-7)，并利用該方法成功篩選到大量的免疫治療新靶標，為建立多靶標聯(lián)合的腫瘤免疫治療方法提供了技術(shù)基礎(chǔ)，獲得工業(yè)界和學(xué)術(shù)界的高度評價和廣泛報道。

參考文獻

He J, Xiong X, Yang H, et al. Defined tumor antigen-specific T cellspotentiate personalized TCR-T cell therapy and prediction of immunotherapyresponse. Cell Res. 2022;10.1038/s41422-022-00627-9.doi:10.1038/s41422-022-00627-9