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測序原理

共有的特點：

優(yōu)點：無需前期擴(kuò)增，不引入偏向性；讀長長

缺點：錯誤率高；

10X Genomics：Illumina二代測序的升級版

10X Genomics，是常規(guī)Illumina二代測序的升級版，由于開發(fā)出了一套巧妙的Barcoding建庫方案，使得Illumina這種短讀長二代測序能夠得到跨度在30-100Kb的linked reads信息，與二代測序數(shù)據(jù)相結(jié)合，在Scaffold的組裝上能夠得到媲美三代測序的組裝結(jié)果

Sequencing principle of 10xgenome

首先將每一條長片段的DNA分配至不同的油滴微粒中，通過專利的GEM建庫技術(shù)，長片段DNA被切碎成適合測序的大小，并且來源于相同油滴(同一條長片段DNA)的DNA片段，會帶上相同的一段DNA序列標(biāo)記(Barcode)，之后在Illumina系統(tǒng)上測序完成后，可以理論上再將來源相同的DNA序列獨立拼接，得到原先的長片段DNA序列。

其GC偏好性如何？

10Xgenome GC bias

10X Genomics技術(shù)相對于Illumina來說，有改進(jìn)，但依舊是個拱形，而PacBio則是無偏倚的均一分布。10X的技術(shù)，其Coverage一樣是受GC含量影響較大的，那么如果真要應(yīng)用10X技術(shù)，那么必須注意目標(biāo)DNA的GC含量分布最好能控制在30～70%。

Helicos：tSMS

真正的單分子測序（Helicos True Single Molecule Sequencing）

Sequencing principle of tSMS

待測DNA 被隨機(jī)打斷成小片段，在每個小片段（ 200bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上隨機(jī)固定多個 poly-dT 引物，其末端皆帶有熒光標(biāo)記，以利于精確定位。

首先，將小片段 DNA 模板與檢測芯片上的poly-dT 引物進(jìn)行雜交并精確定位，然后逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子。這個終止子與 Illumina 的終止子可不一樣，不是四色的，是單色的，也就是說所有終止子都標(biāo)有同一種染料。

在摻入了單個熒光標(biāo)記的核苷酸后，洗滌，單色成像，之后切開熒光染料和抑制基團(tuán)，洗滌，加帽，允許下一個核苷酸的摻入。通過摻入、檢測和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實時讀取大量序列。最后以軟件系統(tǒng)輔助，可分析出完整的核酸序列。

缺點：Heliscope 在面對同聚物時也會遇到一些困難，但可以通過二次測序提高準(zhǔn)確度；由于在合成中可能摻有未標(biāo)記的堿基，因此其最主要的錯誤來源是缺失。

PacBio：SMRT

PacBio SMRT（single molecule real time sequencing）技術(shù)也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想，并以SMRT 芯片為測序載體。

基本原理是：DNA 聚合酶和模板結(jié)合，4 色熒光標(biāo)記4 種堿基（即是dNTP），在堿基配對階段，不同堿基的加入，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。

DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一，讀長主要跟酶的活性保持有關(guān)，它主要受激光對其造成的損傷所影響。

PacBio SMRT 技術(shù)的一個關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來：

它們利用的是ZMW（Zero Mode Waveguide，零模波導(dǎo)孔）原理，如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究，如果直徑大于微波波長，能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長，能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理），從而可起保護(hù)作用。同理，在一個反應(yīng)管（SMRT Cell，單分子實時反應(yīng)孔）中有許多這樣的圓形納米小孔，即ZMW（零模波導(dǎo)孔），外徑100 多納米，比檢測激光波長?。〝?shù)百納米），激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個小范圍（體積20x10^-21L ）里，正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅來自這個小反應(yīng)區(qū)域，孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實現(xiàn)將背景降到最低。

Sequencing principle of SMRT

優(yōu)缺點：

• 優(yōu)點：

  • 可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況，即如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來直接檢測甲基化等信息

    
    
    SMRT can detect base modification

  • 測序速度很快，每秒約10 個dNTP

  • 讀長長

  • 無需PCR擴(kuò)增，也避免了由此帶來的bias

  SMRT features
  • 需要的樣品量很少，樣品制備時間花費少

• 缺點：

  • 測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通病），達(dá)到15%

    
    
    SMRT reads error rate

  好在它的出錯是隨機(jī)的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯

Nanopore sequencing

該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，它們設(shè)計了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA 堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基。

Sequencing principle of Nanopore

測序原理：

1. 解螺旋，將雙鏈DNA解開成單鏈。

2. DNA單鏈分子通過一個孔道蛋白，孔道中有個充當(dāng)轉(zhuǎn)換器的蛋白分子。

3. DNA單分子停留在孔道中，有一些離子通過帶來電流變化，而不同的堿基帶來的電流變化是不同的。

4. 轉(zhuǎn)化器蛋白分子感受5個堿基的電流變化。

5. 根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式識別算法得到堿基序列。

特點：

• 測序讀長

因為測序原理無需要DNA聚合酶的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所以不存在DNA聚合酶的失活問題，理論上只要DNA分子不斷開，就一直可以通過納米孔，目前在對于人和大腸桿菌的測序種觀測到的read是1Mb。

要問測多長，請問您提取的DNA是否夠長？

三種不同建庫方法Nanopore測序情況

DNA建庫方法	序列數(shù)	平均讀長	Read N50
Ligation Library	451，020	8,012	13,920
Rapid Kit Library	315，684	13,796	30,397
Ultralong reads Protocol	694，659	24,179	99,790

數(shù)據(jù)說話，Ligation建庫方法測序讀長的read N50達(dá)到14k左右，超長建庫方法read N50達(dá)到 100k。

• 測序準(zhǔn)確率

Nanopore測序準(zhǔn)確率和Pacbio持平，為86%左右。而且起始位置正確率偏低，在大約100nt位置達(dá)到穩(wěn)定，且錯誤為隨機(jī)測序錯誤。

Nanopore position specific error rate

如果選擇 1D²測序方式，即對于DNA的正負(fù)鏈都進(jìn)行測序，可以達(dá)到96%的準(zhǔn)確率

1D2 reads can imporve correction rate

Nanopore 測序儀 MinION 的一些特征：

1、早期使用基因工程改造過的a-hemolysin蛋白，稱為作為biosensor，最新的nanopore使用CsgG 蛋白，它允許ssDNA通過

2、MinION的flow cells中有512 channels，每個channel含有4個pores和sensors，每個channel作為一個獨立的測序單元，對一條DNA分子進(jìn)行測序，DNA分子從四個納米孔中的一個穿過，產(chǎn)生電流信號。因此一個flow cell可以同時對512條DNA進(jìn)行測序

3、為了進(jìn)行dsDNA的測序，需要在dsDNA的兩端加上兩個接頭：leader-adapter 和 hairpin-adapters，且都被預(yù)先固定在馬達(dá)蛋白 (motor proteins) 上

Nanopore sequencing process

leader-adapter帶著dsDNA到鄰近的納米孔，然后原先固定在leader-adapter的馬達(dá)蛋白開始將dsDNA打開，使得第一條鏈，即模板鏈(template)，能夠穿過納米孔，測序過程隨即開始

Nanopore sequencing process

3、MinION的flow cell有多個升級版本(R6.0, R7.0, R7.3, R9 and R9.4)，在通量，讀長和準(zhǔn)確率方面都有很大的提高

Improvement of Nanopore sequencing quanlity

4、納米孔中的電流傳感器的采樣頻率為5000 Hz，測序速度為250 bases/s（早期為75 bases/s）

5、目前唯一的便攜式DNA和RNA測序儀，注意這里有兩個概念，一是便攜式，MinION只有100g重，相當(dāng)于1個大一點的U盤或者小一點的移動電源；二是DNA和RNA測序，和所有NGS測序儀、甚至三代Pacbio不同的是，MinION和其他的ONT儀器們，可以直接對RNA進(jìn)行測序，無需預(yù)先轉(zhuǎn)化為cDNA。此外，一旦啟動測序，實時的數(shù)據(jù)會不斷產(chǎn)生，而不用像傳統(tǒng)的NGS測序中一個run結(jié)束后才能收獲數(shù)據(jù)，一旦數(shù)據(jù)量足夠可隨時終止測序進(jìn)程，簡直不要太爽！

ONT公司目前推出的幾款測序儀：

• MinION —— flow cell最新版本是R9，內(nèi)含2048 wells。48h即可產(chǎn)出10~20 Gb數(shù)據(jù)

Nanopore device MinION

• GridION X5 —— 一款桌面式測序儀，通量介于大家熟悉的MinIon和高通量的PromethIon之間。GridIon X5系統(tǒng)一次最多可運行五個MinIon flow cells，可以根據(jù)實際數(shù)據(jù)量的需求一次運行1~5個flow cells。目前的最大通量是，每運行48小時可產(chǎn)出高達(dá)100 GB的測序數(shù)據(jù)。

Nanopore device GridION

• PromethION —— 一個具有模塊化設(shè)計的更大的臺式測序儀，其在全功率時的運行能力約為MinION的300倍，通量在Tb級。包括48個flow cells，這些flow cells可以單獨運行，也可以一起運行

Nanopore device PromethION

PacBio-SMRT數(shù)據(jù)分析

QC

1. 下機(jī)數(shù)據(jù)

PacBio rawdata

在analysis文件夾中，下機(jī)的數(shù)據(jù)被分割為三個文件進(jìn)行存儲

• 以bax.h5為后綴的是原始二進(jìn)制文件；
• 以subreads.fasta / subreads.fastq為后綴的是經(jīng)一級處理得到的標(biāo)準(zhǔn)格式的堿基文件；
• 以sts.csv / sts.xml為后綴的是記錄測序過程中每個ZMW度量指標(biāo)的統(tǒng)計文件

數(shù)據(jù)的命名:

m  140415_143853_42175_c100635972550000001823121909121417_s1_p0
└1┘└─────2─────┘ └──3──┘└───────────────4───────────────┘└5┘└6┘

1. m是movie的縮寫；

2. 測序時間，格式為yymmdd_hhmmss；

3. 儀器編號；

4. SMRT Cell Barcode；

5和6無實際意義，一般是固定的

2. 數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)

Pacbio 數(shù)據(jù)的文庫模型是兩端加接頭的啞鈴型結(jié)構(gòu)，測序時會環(huán)繞著文庫進(jìn)行持續(xù)的進(jìn)行，由此得到的測序片段稱為 polymerase reads，即一條含接頭的測序序列，其長度由反應(yīng)酶的活性和上機(jī)時間決定。目前，采用最新的 P6-C4 酶，最長的讀長可達(dá)到 60kb 以上。

Pacbio polymerase reads

polymerase reads 是需要進(jìn)行一定的處理才能獲得用于后續(xù)分析的。這個過程首先是去除低質(zhì)量序列和接頭序列：

PacBio subreads

處理后得到的序列稱為 subreads，根據(jù)不同文庫的插入片段長度，subreads 的類型也有所不同。

對長插入片段文庫的測序基本是少于2 passes的(pass即環(huán)繞測序的次數(shù))，得到的reads也稱為Continuous Long Reads (CLR)，這樣的reads測序錯誤率等同于原始的測序錯誤率。

而對于全長轉(zhuǎn)錄組或全長16s測序，構(gòu)建的文庫插入片段較短，測序會產(chǎn)生多個passes，這時會對多個reads進(jìn)行一致性校正，得到一個唯一的read，也稱為Circular Consensus Sequencing（CCS）Reads，這樣的reads測序準(zhǔn)確率會有顯著的提升。

polymerase reads 與 subreads 是相對應(yīng)的兩個概念
Continuous Long Reads (CLR) 與 Circular Consensus Sequencing（CCS）Reads 是是相對應(yīng)的兩個概念

3. 數(shù)據(jù)質(zhì)量

不同于二代測序的堿基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Q20/Q30，三代測序由于其隨機(jī)分布的堿基錯誤率，其單堿基的準(zhǔn)確性不能直接用于衡量數(shù)據(jù)質(zhì)量。那么，怎么判斷三代測序的數(shù)據(jù)好不好呢？

• 長度

  長度短的測序數(shù)據(jù)不一定差（與文庫大小有關(guān)），但差的數(shù)據(jù)長度一定短。在上游實驗環(huán)節(jié)，最關(guān)鍵的影響因素是文庫的構(gòu)建。高質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度長，質(zhì)量好；而低質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度短，質(zhì)量差。

PacBio reads length

• 比例

需要關(guān)注的是兩個比例：

一個是subreads與polymerase reads數(shù)據(jù)量的比例，比例過低反映測序過程中的低質(zhì)量的序列較多；

一個是zmw孔載入的比例，根據(jù)孔中載入的DNA片段數(shù)分為P0、P1和P2。P1合理比例在40%-60%之間。上樣濃度異常會導(dǎo)致P0或P2比例過高，有效數(shù)據(jù)量減少。需要注意的是P2比例過低時，可能存在P2轉(zhuǎn)P1的情況，測序結(jié)果包含較多的嵌合型reads。

PacBio QC-quality zmw loading

一張芯片上有15萬個孔，其中只有大概三分之一有一個測序復(fù)合物（聚合酶＋測序引物＋測序模版），另外三分之一是空的，剩下的三分之一是有>2個以上的測序復(fù)合物產(chǎn)生的數(shù)據(jù)再接下來的分析中是要去掉

組裝

目前采用的組裝策略：

• PacBio-only de novo assembly ：只使用 PacBio 產(chǎn)生的 long reads 進(jìn)行拼接，在拼接之前要進(jìn)行預(yù)處理，然后采用 Overlap-Layout-Consensus 算法進(jìn)行拼接

• Hybrid de novo assembly ：結(jié)合 PacBio 的長reads 和 二代的短 reads

• Gap filling ：用二代的短reads（包括Pair-end和Mate-pair reads）拼接得到scaffod，然后用 PacBio 的長 reads 進(jìn)行補洞

• Scaffolding ：用二代的短reads（包括Pair-end和Mate-pair reads）拼接得到 contigs / scaffod，用 PacBio 的長 reads 確定 contigs / scaffod 之間的位置關(guān)系

PacBio assembly approaches

這四種組裝策略并不是完全孤立的，在一個組裝任務(wù)的不同階段會用到不同的方法

不同的組裝策略可以選用的工具：

1. PacBio-only

   • HGAP：先進(jìn)行reads的預(yù)組裝(preassembly)，然后用Celera^? Assembler進(jìn)行進(jìn)一步組裝，最后用 Quiver 進(jìn)行校正
   • Falcon：一個試驗性的二倍體組裝工具，已經(jīng)在Gb級別大小的基因組上做了試驗
   • Canu：以Celera Assembler為基礎(chǔ)，為三代單分子測序而開發(fā)出的分支工具
   • Celera^? Assembler：現(xiàn)在，Celera^? Assembler 8.1 已經(jīng)可以直接用于subreads的組裝

2. Hybrid

   • pacBioToCA：Celera^? Assembler的一個error correction模塊，最初是用來align short reads to PacBio reads 和 generate consensus sequences。隨后，這些錯誤校正過的PacBio reads可以用Celera^? Assembler進(jìn)行組裝
   • ECTools：使用 unitigs (High quality contigs formed from unambiguous, unique overlaps of reads) 而非short reads進(jìn)行校正
   • SPAdes ：SPAdes原本是進(jìn)行短序列組裝，在3.0版本后增加了對PacBio的混合組裝的支持
   • Cerulean ：用ABySS構(gòu)建de Bruijn graph，在圖的bubbles位置利用PacBio的long reads解決bubbles帶來的分支選擇問題，從而延伸contigs

3. Gap Filling

   PBJelly 2 ：對已經(jīng)組裝過的基因組，用PacBio的long reads進(jìn)行補洞

3GS assembly algorithms

de novo assembly 算法

基因組的組裝問題，實際上就是從序列得到的圖中搜尋遍歷路徑的問題，有兩種構(gòu)建圖的方法：

• overlap-layout-consensus (OLC)
• de Bruijn graph

3GS PacBio assembly: compare 2 algorithms

可以看到，隨著reads長度的增加，基于OLC算法的組裝工具組裝出的contigs的長度幾乎在線性增長，而基于de Bruijn圖算法的組裝效果并沒有隨著reads長度的增加而提高

三代單分子測序會產(chǎn)生較高的隨機(jī)錯誤，平均正確率在82.1%-84.6%。這么高的錯誤率顯然不能直接用于后續(xù)的分析，需要進(jìn)行錯誤校正：

• 多測幾個pass：由于測序序列是發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)行多輪的滾環(huán)測序，靠覆蓋度來自我糾錯，如果通量不是限制因素，那么PacBio是目前最準(zhǔn)確的測序方式：錯誤率可以無限接近罕見突變的發(fā)生率（即無法分辨是測序錯誤還是罕見突變），不過這會極大縮短有效測序的插入序列的長度

• 用二代的短reads校正：2012年冷泉港實驗室的Michael Schatz開發(fā)了一種糾錯算法，用二代測序的短讀長高精確數(shù)據(jù)對三代長讀長數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯，這種稱為”混合糾錯拼接”（PBcR (PacBio corrected Reads) algorithm）

• Map short reads to long reads
• Trim long reads at coverage gaps
• Compute consensus for each long read

3GS assembly: error correction by NGS short reads

粉色長方形：單個PacBio RS reads；黑色豎線：測序錯誤；(a)由于測序錯誤堿基的存在使得兩條reads就難確定是否在末端重疊；(b)高質(zhì)量的短reads比對到存在錯誤的長reads；短reads中的黑色豎線表示 ‘mapping errors’ ，是長reads和短reads中測序錯誤的組合，此外雙拷貝的重復(fù)序列的存在（灰色輪廓）導(dǎo)致在每一個拷貝中出現(xiàn)短reads的堆擠，為避免reads map到錯誤的重復(fù)區(qū)，僅保留最高比對值的短reads；(c)剩余的比對形成一致性序列（紫色長方形），長reads和短reads中共有的部分錯誤未能得到糾正；(d)overlap糾正后的長reads；(e) 最后的組裝能夠跨越重復(fù)區(qū)域。

校正過程中會將short reads未覆蓋到的Gap進(jìn)行裁剪，short reads在PacBio long reads上的覆蓋情況：

這樣做的其中一個考慮是去除adapter

Position specific coverage and error rate

那么是什么原因?qū)е铝说透采w度區(qū)域的產(chǎn)生的呢？

1. Simple Repeats – Kmer Frequency Too High to Seed Overlaps
2. GC Rich Regions – Known Illumina Bias
3. Error Dense Regions – Difficult to compute overlaps with many errors

Position specific coverage and error rate

3GS-assembly-error-correction-position-coverage-3.png

為了克服第三中情況導(dǎo)致的高測序錯誤率區(qū)域的低覆蓋度，研究人員提出了用Unitigs進(jìn)行校正的方法

Pacbio error correction by Unitigs

Nanopore數(shù)據(jù)分析

Base-calling

Base-calling做的就是從測序儀輸出的電流信號波形圖中將堿基解碼 (decoding) 出來

第一步就是就是對波形圖進(jìn)行分段 (segmentation)，即檢測每個current shift的邊界，這一步由ONT公司提供的 MinKNOW 完成，但是分段基于的假設(shè)是ssDNA分子勻速穿過nanopores，但是由于ssDNA穿過nanopore的速度很快，很容易產(chǎn)生一兩個堿基的速度差異，這樣就容易在decoding時造成insert和delete

Nanopore base calling

接著就基于current shift進(jìn)行base calling，ONT公司提供的base caller為Metrichor，其底層算法基于HMM，將可能的k-tuple（由k個堿基組成的序列）作為隱藏狀態(tài)，將current signals作為觀測狀態(tài)。ONT公司最新開發(fā)出的Metrichor用RNN取代了HMM，并將其整合到其開發(fā)出的新的生物信息數(shù)據(jù)分析平臺EPI2ME中

隨后，科研圈又開發(fā)出了開源的base calling工具，Nanocall 和 DeepNano。

• Nanocall類似于Metrichor，也是基于HMM。
• DeepNano 采用的是RNN（循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)），又稱為RNN base-caller，其輸入為：mean, SD and duration of each segmented event ，其輸出為各種堿基的概率分布。DeepNano在base calling準(zhǔn)確率和計算速度上，都比ONT官方提供的Metrichor表現(xiàn)更好

DeepNano outperforms the Metrichor basecaller in terms of both accuracy (from 70 to 75% 
sequence identityfor 1D read and from 85 to 87% for 2D reads) and computational speed
 (190 s for a 2D read with Metrichor and 11 s with DeepNano)

ONT后來又在github上開源了一個RNN base-caller —— Nanonet

Data formats and handling

測序時，測序儀 MinION 連接上主機(jī)，安裝在主機(jī)上的軟件 MinKNOW 控制測序儀，對于每條reads，其 signal segmentation 結(jié)果（包括segment mean, variance and duration）以及測序過程中的 metadata 會被保存成FAST5格式的二進(jìn)制文件（基于 HDF5標(biāo)準(zhǔn) 的變種）。

保存在FAST5文件中的原始數(shù)據(jù)會經(jīng)過云端的Metrichor的處理，產(chǎn)生的解碼的序列會被保存在另外的以.FAST5為后綴的HDF5文件中，包含一條template read和一條complement read或只有一條 2D read 。

Nanopore 2D reads

MAP (MinION Access Programme) community 開發(fā)出的用于處理FAST5文件的工具，它們均能從FAST5文件中解析出FASTA/FASTQ文件，除此之外還有各自特色的質(zhì)量統(tǒng)計功能：

• Poretools： 輸出quality plot，包括read-length histograms，yield-over-time
  plots，和 squiggle plot (sequence of the segmented signals)

• NanoOK：評估三種類型的測序錯誤（substitutions, insertions and deletions），并繪制errors， coverage 和 k-mer 分布圖

• npReader：能夠在測序進(jìn)行過程中，進(jìn)行實時評估，以GUI形式展示質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果

Nanopore data formate handling tools

參考資料：

(1) 生物技能樹論壇：PacBio sequence error correction amd assemble via pacBioToCA

(2) 天津醫(yī)科大學(xué)，伊現(xiàn)富《系統(tǒng)生物學(xué)-chapter2》

(3) Nanopore 第四代測序技術(shù)簡介

(4) Magi A, Semeraro R, Mingrino A, et al. Nanopore sequencing data analysis: state of the art, applications and challenges.[J]. Briefings in Bioinformatics, 2017.

(5) 細(xì)節(jié)曝光！Oxford Nanopore真機(jī)還原，聽聽圈內(nèi)人怎么說

(6) 三代測序--QC篇

(7) PacBio Training: Large Genome Assembly with PacBio Long Reads

(8) Koren S, Schatz M C, Walenz B P, et al. Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(7):693-700.

(9) 冷泉港ppt：Hybrid De Novo Assembly of Eukaryo6c Genomes

(10) Leggett R M, Darren H, Mario C, et al. NanoOK: multi-reference alignment analysis of nanopore sequencing data, quality and error profiles[J]. Bioinformatics, 2016, 32(1):142-144.