限制性內(nèi)切酶分類繁多，根據(jù)切割位點(diǎn)類型分為3類 ，切得老遠(yuǎn)老遠(yuǎn)的是I型；切割識(shí)別位點(diǎn)外25個(gè)bp左右的是III型；切割識(shí)別別位點(diǎn)及其附近的是II型。II型還有特定的亞型，包含IIS類，切割識(shí)別位點(diǎn)之外5-6個(gè)剪輯對(duì)的序列，簡(jiǎn)略比較圖如下：

compare

上圖我將II型默認(rèn)為我們常規(guī)用到的Ⅱ型酶（IIP型），由于II型酶還有各類亞型，為了方便后續(xù)學(xué)習(xí)，我們先簡(jiǎn)單了解一下II型酶家族都有哪些分類以及特征。

1. II型限制性內(nèi)切酶家族

數(shù)量：II型限制性內(nèi)切酶是日常分子生物學(xué)中最常見(jiàn)的酶，如基因克隆和DNA片段分析。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)3500種II型酶，可識(shí)別超過(guò)350種DNA序列。通過(guò)對(duì)細(xì)菌和古細(xì)菌基因組的分析，已確定了數(shù)千種II型酶，但其特征仍未確定。

命名：限制性內(nèi)切酶依據(jù)發(fā)現(xiàn)它們的微生物命名。例如，HindIII叫Hin d three是在流感嗜血桿菌（<u>H</u>aemophilus influenzae）<u>d</u>血清型中發(fā)現(xiàn)的第<u>3</u>種內(nèi)切酶，由此可第二種和第一種則分明名為HindI、HindII。有時(shí)添加前綴r以區(qū)分限制性內(nèi)切酶與它們細(xì)胞內(nèi)的修飾酶。因此，R.HindIII專指限制性內(nèi)切酶，M.HindIII專指修飾酶。當(dāng)無(wú)歧義時(shí)，前綴r被省略。

Hind3

常規(guī)亞分類： Type IIP, IIS, IIC, and IIT。II型酶分類有多達(dá)十幾種，有機(jī)會(huì)的話我們可以詳細(xì)討論各種亞分類的不同結(jié)構(gòu)以及為何會(huì)產(chǎn)生不同的切割結(jié)果（挖坑），想要自行學(xué)習(xí)的小伙伴可在文末查看我們推薦的文獻(xiàn)。下面我們簡(jiǎn)單介紹一下常規(guī)使用的幾種II酶亞類的區(qū)別。

大家一定好奇，II后面的字母是如何來(lái)的呢？

(1) IIP（<u>P</u>alindromic）：IIP型是最重要的亞型，占分子生物學(xué)中酶的90%以上 ，識(shí)別長(zhǎng)度為4到8個(gè)堿基對(duì)的回文序列，切割位點(diǎn)也通常在該序列內(nèi) 。大多數(shù)IIP型酶識(shí)別特異的DNA序列，每個(gè)位置只能有一個(gè)特定的堿基對(duì)(例如BglII: AGATCT)，但一些IIP型酶可識(shí)別簡(jiǎn)并（模糊）序列，其中可以有不同的堿基對(duì)。

(2) IIS（<u>S</u>hifted cleavage）：IIS型酶在識(shí)別序列之外的固定位置切割DNA。裂解點(diǎn)移（shift）到序列的一側(cè)。IIS就是GG克隆使用到的酶類。

(3) IIC（<u>C</u>ombined）：同時(shí)具有內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性。限制性內(nèi)切酶大部分是由細(xì)菌和古菌產(chǎn)生的，其對(duì)宿主細(xì)胞具有潛在毒性，而對(duì)限制性內(nèi)切酶的保護(hù)性解毒劑會(huì)以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的形式產(chǎn)生。這種酶識(shí)別與限制性內(nèi)切酶相同的序列，通過(guò)化學(xué)方法改變細(xì)胞自身DNA的每個(gè)位點(diǎn)，防止其被裂解。而這種DNA修飾包括甲基化，可通過(guò)形成空間位阻，阻止限制性內(nèi)切酶與該位點(diǎn)結(jié)合。IIC型酶可以同時(shí)催化兩種相互競(jìng)爭(zhēng)的反應(yīng)：酶切和甲基化。甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)普遍需要輔助因子s -腺苷蛋氨酸(SAM)。有些IIC型酶在裂解時(shí)也需要SAM，有些僅僅受到SAM的刺激，還有一些根本不需要SAM。如果存在SAM，甲基化會(huì)隨著裂解而進(jìn)行，從而阻止完全消化。IIC型酶在分子生物學(xué)中應(yīng)用不多，所以我也并未用過(guò)這種酶。

(4) IIT（<u>T</u>wo different subunits or <u>T</u>wo different catalytic ）：異源二聚體限制性內(nèi)切酶，包含兩個(gè)不同的亞基，或具有兩個(gè)不同的催化位點(diǎn)。

2. Golden Gate克隆特性

通過(guò)以上描述，我們得到的最直觀信息是：（1）IIS型裂解識(shí)別序列外的序列；（2）IIS型為無(wú)痕連接。因而可以推測(cè)GG克隆的特性：

（1）切割識(shí)別序列外序列， 則說(shuō)明切割位點(diǎn)并不特異，任意序列只要在這附近有特異性的IIS型酶識(shí)別位點(diǎn)即可，這就提供了酶切的無(wú)限可能！

（2）無(wú)痕連接：切割后若為自連，則IIS酶會(huì)不斷酶切自連位置，因此自連產(chǎn)物幾乎不太可能會(huì)被轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞（只有酶切不完全的情況下，會(huì)有原始質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入感受態(tài)的可能）；切割后若連接成功則丟失酶切位點(diǎn)，因而只要連接，即是成功?；谶@個(gè)特性，酶切和連接可以在同一試管內(nèi)完成，無(wú)需酶切回收片段后再連接，該效率堪比Gibson assembly。

BbsI

（3）速度快、效率高：由于切割和連接可在同一管內(nèi)完成且效率幾近100%，因此反應(yīng)在半小時(shí)內(nèi)即可完成。

（4）多片段可同時(shí)組裝，只要插入片段兩端酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)得當(dāng)，即可同時(shí)連接多達(dá)10個(gè)以上片段。

Golden Gate克隆示意圖

下圖描述了兩種常用的插入片段制備辦法，無(wú)論是酶切還是PCR，其根本還是要產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，因此只要粘性末端設(shè)計(jì)得當(dāng)，可同時(shí)插入多種片段。具體的方法可參考2020年新發(fā)表的文章：Synthetic DNA Assembly Using Golden Gate Cloning and the Hierarchical Modular Cloning Pipeline，具體信息在文末給出。該文描述了5種basic protocol，并給出了案例分析以及實(shí)驗(yàn)條件，由于本文篇幅有限，則不再展開該文，但非常值得一讀。

basic protocol

3. 案例學(xué)習(xí)

在我們前面CRISPR-Csa9實(shí)驗(yàn)記錄系列推文中，將sgRNA插入到Cas9質(zhì)粒這個(gè)步驟使用的就是GG克隆的方法。接下來(lái)我們?nèi)砸赃@個(gè)克隆為例，分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案以及實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整用意。

3.1 準(zhǔn)備gRNA oligo片段，一般使用梯度退火即可達(dá)到互補(bǔ)配對(duì)的效果

原設(shè)計(jì)匯總sgRNA的獲取是通過(guò)PCR擴(kuò)增的，PCR產(chǎn)生的線狀DNA產(chǎn)物需要通過(guò)T4 PNK進(jìn)行磷酸化，以提高后續(xù)連接效率。而我們的方案中由于使用的載體是 pSpCas9(BB)-2A-GFP，載體經(jīng)過(guò)改進(jìn)，BbsI兩位點(diǎn)在U6啟動(dòng)子后面，gRNA scaffold前面，因此只需要將那20 nt長(zhǎng)度的gRNA序列插入即可。而這gRNA序列是公司合成的，無(wú)須再進(jìn)行磷酸化。

step1

3.2 使用Golden Gate克隆將gRNA片段插入

經(jīng)過(guò)調(diào)整，將T7連接酶改為T4連接酶，而T4連接酶的緩沖液已經(jīng)帶有DTT、ATP等成分，無(wú)須另外添加。雖然我們總是說(shuō)GG克隆可以在30分鐘內(nèi)完成反應(yīng)，但在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們使用的是37℃與25℃交替反應(yīng)6個(gè)循環(huán)，即為酶切-連接進(jìn)行6個(gè)循環(huán)。在酶切-連接6個(gè)循環(huán)結(jié)束后，添加一個(gè)37℃ 30 min的步驟用于酶切未完全酶切的載體質(zhì)粒，以減少感受態(tài)轉(zhuǎn)化后的自連克隆。同時(shí)添加65℃ 5 min步驟用于失活BbsI和T4連接酶，以免對(duì)感受態(tài)細(xì)胞造成傷害。

step2

4. Golden Gate應(yīng)用

4.1 合成生物學(xué)

合成生物學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出一種模塊化克隆策略MoClo，它使用IIS型限制性內(nèi)切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地組裝多達(dá)6個(gè)DNA片段。這種方法利用IIS型酶在識(shí)別位點(diǎn)外切割的能力，并允許具有兼容懸端的DNA片段被有效組裝。
通過(guò)設(shè)計(jì)出獨(dú)特的酶識(shí)別位點(diǎn)，使DNA模塊的側(cè)翼呈反向方向，這樣多個(gè)DNA組分就可以在一個(gè)單一反應(yīng)中定向組裝，而在兩者之間只保留一個(gè)確定的4bp融合位點(diǎn)。

MoClo系統(tǒng)由三組克隆載體（Level 0, Level 1, Level 2）組成，可以在三個(gè)連續(xù)的組裝步驟中使用。
（1）在開始之前，將包含基本部分（啟動(dòng)子、utr、編碼序列、終止子等）的DNA片段插入到單個(gè)的level 0質(zhì)粒中；

（2）在第一步組裝中，兼容的level 0被定向組裝成level，創(chuàng)建一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元（例如:啟動(dòng)子、5 UTR、編碼區(qū)域和終止子）。
（3）接下來(lái)，多達(dá)6個(gè)level 1模塊可以類似地組裝成level 2，從而形成一個(gè)基因結(jié)構(gòu)。
在最后的組裝步驟中結(jié)合多個(gè)2級(jí)載體可以創(chuàng)建更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。

MoClo

4.2 基因工程

就如我們上面舉的案例一樣，在CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)中，我們用到GG克隆將gRNA有效的插入到Cas9質(zhì)粒中。此外基于GG克隆強(qiáng)大的DNA片段組裝能力，可使用GG克隆高效組裝TALEN以及TAL序列，從而參與基因編輯工作。具體信息可以查看我們文末提到的參考資料。其實(shí)只要是用到質(zhì)粒改造的領(lǐng)域，GG克隆都有可能參與。因此無(wú)所謂它到底應(yīng)用在哪兒了。

5. 結(jié)語(yǔ)

GG克隆雖然有效率高、速度快且操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。從多組分組裝來(lái)說(shuō)，Gibson assembly仍相當(dāng)具有競(jìng)爭(zhēng)力。同傳統(tǒng)限制性克隆一樣，插入片段中如若含相同的IIS型酶切位點(diǎn)，會(huì)造成額外的酶切，因此IIS酶的酶切只能存在對(duì)的位置。而如果插入片段中含有同樣的識(shí)別位點(diǎn)，可通過(guò)PCR對(duì)該片段進(jìn)行點(diǎn)突變沉默。而如果插入片段的相同IIS酶切位點(diǎn)太多無(wú)法完成突變時(shí)，可考慮使用Gateway克隆。我們之后也會(huì)單獨(dú)寫一篇Gateway克?。ɡ^續(xù)挖坑）。

對(duì)于非合成生物學(xué)、基因工程領(lǐng)域的我們，平時(shí)用到GG克隆的情況不多。首先IIS型酶種類并不算特別多，目前NEB上約有50種；其次與傳統(tǒng)限制性克隆一樣，GG克隆仍然依賴酶切識(shí)別位點(diǎn)；載體或者插入片段同時(shí)擁有合適酶切位點(diǎn)的情況不多見(jiàn)，還需要通過(guò)PCR對(duì)插入片段額外引入粘性末端，這個(gè)操作過(guò)程與Gibson assembly差不多一致，因此大多數(shù)情況大家還是會(huì)選擇Gibson assembly。然而Gibson assembly依賴可同源重組的粘性末端，當(dāng)載體中具有相似同源片段時(shí)會(huì)有錯(cuò)配的可能，此時(shí)可考慮使用GG克隆。

今天就到此為止，謝謝大家。