1. Author
Patrick C.Wilson畢業(yè)于德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心，后續(xù)在紐約洛克菲勒大學(xué)Michel Nussenzweig實驗室接受了博士后培訓(xùn)。Patrick主要關(guān)注B細(xì)胞生物學(xué)、抗體庫表征以及從單個人類B細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的開發(fā)上。Patrick還關(guān)注人類B細(xì)胞和抗體對流感的反應(yīng)，例如在感染與疫苗接種期間，臨床試驗中對新型流感疫苗的反應(yīng)，或從年輕到年老的不同年齡組對流感疫苗或感染的反應(yīng)。
2. Background
季節(jié)性疫苗在很大程度上驅(qū)動了針對血凝素（HA）頭域的抗體反應(yīng)。而不是針對保守的stalk結(jié)構(gòu)域的抗體。下一代疫苗旨在通過靶向保守的表位來產(chǎn)生對多種流感病毒亞型的持久和廣泛的保護(hù)性免疫。目前比較理想的疫苗策略是嵌合HA（cHA），其stalk衍生自2009年大流行H1N1，頭部是來自禽類的A型流感亞型。頭部的免疫原性對于人類來說為初始的。有研究表明這種疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的保守的廣譜并且擁有很好的保護(hù)效果。
在一期臨床實驗中發(fā)現(xiàn)，含有角鯊烯佐劑（AS03）的cHA疫苗可以誘導(dǎo)ASCs何莖部靶向的血清抗體反應(yīng)。接種cHA的個體血清具有廣泛的結(jié)合活性，通過莖特異性抗體反應(yīng)抑制神經(jīng)氨酸酶，ADCC活性。同時就免疫策略而言，滅活＋AS03的連續(xù)兩次免疫可以誘導(dǎo)最持久的血清抗體反應(yīng)。
3. Methods
單克隆抗體制造
病毒與重組蛋白的表達(dá)
ELISA
中和實驗
抗體依賴的細(xì)胞毒性作用（ADCC）
ELISpot 實驗
生物膜衍射技術(shù)
單細(xì)胞RNA測序與分析
譜系與克隆分析
抗體結(jié)合印記譜
4. Results
4.1 cH5/1+ B細(xì)胞的scrna序列揭示了不同的轉(zhuǎn)錄亞群
為了研究接種cHA疫苗后B細(xì)胞組成情況，實驗團(tuán)隊在多個時間點(diǎn)用不同的cHA疫苗策略免疫，檢測了各組得B細(xì)胞分群情況。cH8/1N1誘導(dǎo)后7天和cH5/1N1增強(qiáng)后第92天。并從CD19+CD27++CD38++ASCs含量大于0.5%的個體中分離PBs，并進(jìn)行單BCR擴(kuò)增和克隆。PB群富含激活的MBCs，具有很強(qiáng)的病毒特異性。滅活苗+AS03的在cH8/1N1和cH5/1N1免疫后能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)cHA特異性的PBs。實驗團(tuán)隊利用基因集富集分析(GSEA)將這6個細(xì)胞群的基因表達(dá)模式與不同B細(xì)胞亞群的基因表達(dá)模式進(jìn)行了比較，包括幼稚B細(xì)胞(NBCs)、靜止B細(xì)胞(RMBCs)、非典型B細(xì)胞(atMBCs)、活化B細(xì)胞(ABC)、ASCs。第3群富集了NBC，而第2群對任何中群沒有富集，因為它們在很大程度是轉(zhuǎn)錄靜止的。此外，1、4、5和6群在不同的軌跡上都表現(xiàn)出ABC的特征，1、4和6群富含與ASCs相關(guān)的基因。5群高表達(dá)atMBCs相關(guān)的基因。此外，4、5和6群中的細(xì)胞表達(dá)高水平的主要組織相容性復(fù)合體II類(MHC II類)分子，表明最近與CD4+T細(xì)胞和潛在的生發(fā)中心(GC)遷移有同源相互作用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明5群類似于CD21lo群和atMBCs，而4和6群分別是潛在的GC遷移者，為MBC和ASC分化做準(zhǔn)備。最后，來自滅活苗+AS03組的cHA結(jié)合B細(xì)胞更可能成為ABC群(1,4,5和6)中的細(xì)胞，而僅IIV組的靜止B細(xì)胞群的B細(xì)胞豐富。此外，第1組和第2組中ABC群的富集與血清抗體滴度ASC反應(yīng)一致，這表明接受IIV+AS03的供體具有卓越的B細(xì)胞活化。
4.2 cH5/1+ B細(xì)胞簇表現(xiàn)出不同的抗體同型和體細(xì)胞超突變譜
通過轉(zhuǎn)錄組水平聚類分析了B細(xì)胞分群后，接下來實驗團(tuán)隊試圖確定這些B細(xì)胞群是否與不同的抗體類別轉(zhuǎn)化和體細(xì)胞超突變譜相關(guān)。3群的B細(xì)胞主要以IgM和IgD為主，但突變頻率低。相比之下，其他群的細(xì)胞很大程度轉(zhuǎn)換為IgG亞型。
4.3 cH5/1+特異記憶B細(xì)胞和cHA誘導(dǎo)漿細(xì)胞的譜系表征
Stalk特異性的抗體通常由經(jīng)典的IgV基因編碼。由于人類對禽類的H5頭部沒有預(yù)存的免疫力，因此在113天分選得到的B細(xì)胞很有可能是靶向Stalk結(jié)構(gòu)域的。通過重輕鏈配對分析，發(fā)現(xiàn)cH5/1的B細(xì)胞庫呈現(xiàn)多樣性。Stalk富集了VH1-69+Kappa；靶向HA的anchor位點(diǎn)富集了VH3-23/3-30/3-48+ VK3-11/3-15；靶向HA三聚體界面頭部的VH4+VK1-39。相比于獨(dú)特克隆型，靶向于Stalk克隆擴(kuò)增的克隆型中VH1-69+Kappa被顯著富集。MBCs和PBs之間共享的多個克隆是公共克隆，表明cHA疫苗接種導(dǎo)致參與者在多個時間點(diǎn)的限制性B細(xì)胞趨同。對最大的私有克隆和最大的公共克隆的分析顯示，克隆型在多個轉(zhuǎn)錄集群中都有代表，特別是與激活記憶和ASC相關(guān)群1、4和5。這些數(shù)據(jù)表明，接種cHA疫苗可以激活和擴(kuò)增克隆?？傊?，cHA疫苗激活并導(dǎo)致B細(xì)胞針對HA莖結(jié)構(gòu)域的保守表位擴(kuò)增。
4.3 體細(xì)胞超突變的cH5/1+ B細(xì)胞主要靶向stalk區(qū)域
為了進(jìn)一步探索boost28天后的cH5/1 B細(xì)胞的表位特異性，實驗團(tuán)隊合成了175個單克隆抗體，占據(jù)之前scRNA-seq分析的所有B細(xì)胞的10%。其中群3中特異性抗體合成最多，在轉(zhuǎn)錄分析上這群細(xì)胞與NBC相似。接下來實驗團(tuán)隊聚焦在體細(xì)胞超突變的cH5/1+單克隆抗體上。將V基因上突變＞2的定義為經(jīng)歷過體細(xì)胞突變。發(fā)現(xiàn)74%的單克隆抗體靶向于Stalk，而8%靶向于頭部結(jié)構(gòu)域。另一方面，實驗團(tuán)隊通過競爭實驗檢測抗體是否與central stalk（CR9114）、anchor（222-1C064）、HA頭部三聚體界面（FluA-20）競爭。在與Stalk結(jié)合的單克隆抗體中，44%靶向anchor，22%靶向central stalk的。各疫苗組特異性B細(xì)胞的比例也不相同，其中1組（LAIV/IIV+AS03）富集更多的anchor和central stalk單克隆抗體。除此以外，記憶B細(xì)胞根據(jù)特異性的不同分為幾個群。其中stalk靶向的B細(xì)胞富集在群1（ASC/ABC），頭部靶向的B細(xì)胞富集在群5（atMBC），靶向未知H1表位的B細(xì)胞富集在群2。同時實驗團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)針對anchor表位的幾個B細(xì)胞克隆擴(kuò)增，包括了另一項研究中季節(jié)性疫苗誘導(dǎo)的PB克隆擴(kuò)增。HA anchor克隆成員跨越多個轉(zhuǎn)錄簇，提示該該克隆被cHA激活。這些數(shù)據(jù)表明，cHA疫苗可以誘導(dǎo)B細(xì)胞對抗多種表位，包括廣泛保護(hù)的central stalk、HA anchor和HA頭三聚體界面表位。
4.4 H1+ B細(xì)胞的結(jié)合和中和能力
能夠結(jié)合California-09 H1的單克隆抗體中有61%的單抗可以中和該類病毒。而靶向于stalk的中和抗體中，90%為central stalk靶向的。此外，100%靶向anchor和central stalk表位的單克隆抗體為中和抗體。單克隆抗體對未知stalk表位的中和效力相對于對anchor和中central stalk表位的中和效力顯著降低。結(jié)合在cH8/1和H1的漿細(xì)胞來源單克隆抗體中，只有30%為中和抗體。從PBs和MBC中分離的中和性和非中和性單克隆抗體的譜相似。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析B細(xì)胞抗體的中和情況，發(fā)現(xiàn)70%的單克隆抗體是從激活的記憶樣群1、4、5中分離出來的。2群中的單克隆抗體只有三分之一。疫苗組1(LAIV/IIV + AS03)相比于其他兩個組具有更大比例的單克隆抗體。由于第一組的B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)富集了ABC簇，表明IIV+AS03這種免疫策略驅(qū)動了更大的體細(xì)胞突變并且具有更多的中和抗體。同時，靶向central stalk的單克隆抗體都具有ADCC活性，而靶向HA stalk未知表位的抗體則沒有。
4.5 cHA疫苗可誘導(dǎo)持久的stalk靶向MBCs
之前數(shù)據(jù)表明，用IIV +AS03佐劑接種cHA可促進(jìn)針對HA頭部和stalk廣譜保護(hù)性表位的PB和MBC應(yīng)答。第4組接種了cH8/1 IIV + AS03，并增強(qiáng)了cH5/1 + AS03，在免疫后至少420天誘導(dǎo)了持久的stalk特異性血清抗體滴度。后續(xù)確定了cHA IIV+AS03疫苗重塑針對H1得B細(xì)胞庫并誘導(dǎo)持久的stalk特異性MBCs。對接種后420天的個體中獲得了14126個B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和BCR。對接種2020-2021年季節(jié)性流感疫苗182天后，使用相同的方法產(chǎn)生7,119個單細(xì)胞的數(shù)據(jù)。群2、4、5和9富含與ABC相關(guān)的基因；群2、4、5、8和9富集ASC樣基因；群9富集atBC相關(guān)基因；0群富集NBC樣基因。并且通過與季節(jié)性流感接種者相比，cHA疫苗能夠引起持久的特異性Stalk特異性MBCs。
5. Discussion
作者：Jenna J. Guthmiller
通訊作者：Patrick C.Wilson
單位：Department of Medicine,Section of Rheumatology, University of Chicago
年份：2025.4.8
期刊：Immunity
科學(xué)問題 ：cHA疫苗接種誘導(dǎo)的B細(xì)胞亞群和抗體譜情況，對MBC的長期影響。
討論：研究聚焦于添加了基于角鯊烯的佐劑（AS03）的cHA滅活疫苗。通過單細(xì)胞RNA測序和B細(xì)胞受體庫測序，作者對疫苗接種誘導(dǎo)的B細(xì)胞的特異性、功能和亞群進(jìn)行了表征。他們發(fā)現(xiàn)，該疫苗能強(qiáng)力誘導(dǎo)針對HA莖干結(jié)構(gòu)域中兩個廣泛中和表位的活化B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞（MBC）。這表明該疫苗有效地靶向了病毒的保守區(qū)域，這些區(qū)域不易發(fā)生抗原漂移。
對?B?細(xì)胞反應(yīng)的分析揭示了急性漿母細(xì)胞（PB）和MBC之間的克隆重疊，這表明B細(xì)胞趨同于這些具有廣泛保護(hù)作用的表位。這種趨同是有效免疫反應(yīng)的關(guān)鍵特征，因為它能使機(jī)體對病毒發(fā)起更協(xié)調(diào)、更有效的攻擊。通過靶向保守表位，cHA疫苗或許能夠克服傳統(tǒng)季節(jié)性疫苗的局限性，傳統(tǒng)季節(jié)性疫苗通常依賴于靶向可變表位，而這些可變表位會因抗原漂移而迅速變化。
免疫接種一年后，作者觀察到cHA疫苗接種重塑了HA特異性MBC庫，使其富含結(jié)合莖干的B細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)意義重大，因為它證明了疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有長期持久性。結(jié)合莖干的B細(xì)胞比例增加，表明該疫苗能夠針對流感病毒產(chǎn)生更強(qiáng)有力且持久的免疫力。在出現(xiàn)大流行威脅的背景下，這一點(diǎn)尤為重要，因為快速有效的免疫反應(yīng)對于預(yù)防病毒傳播至關(guān)重要。
此外，該研究還識別出cHA疫苗接種后B細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄亞群。這些亞群與不同的抗體同種型和體細(xì)胞超突變譜相關(guān)，為B細(xì)胞反應(yīng)的成熟和多樣化提供了見解。例如，一些亞群富含與活化B細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞相關(guān)的基因，而其他亞群則類似于未成熟或非典型MBC。了解這些亞群對于優(yōu)化疫苗設(shè)計和提高流感疫苗的有效性至關(guān)重要。
除了B細(xì)胞亞群，研究人員還對cHA誘導(dǎo)的PB和MBC的庫特征進(jìn)行了表征。他們發(fā)現(xiàn)，抗cHA的B細(xì)胞庫高度多樣化，但明顯富集了針對保守表位（如中央莖干和HA錨定區(qū)域）的B細(xì)胞。這種多樣性可能有助于疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生廣泛的反應(yīng)性，使其能夠識別和中和多種流感病毒株。
