前言
通過這篇文章，希望對水稻的原生質(zhì)體大小、亞細(xì)胞定位和BiFC等實(shí)驗(yàn)有個大概的認(rèn)識。
以萬建民院士團(tuán)隊相關(guān)文章為例
聽我老師說，萬建民院士團(tuán)隊里有個專業(yè)制備原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)化拍片的高手，很是羨慕啊，真想向他取取經(jīng)，如果有讀者認(rèn)識的，請在評論區(qū)告訴一下小編啊，好，接下來研讀文獻(xiàn)。
1. OsRE1與OsRIP1相互作用，通過調(diào)控Ehd1的表達(dá)來調(diào)控水稻抽穗期
OsRE1 interacts with OsRIP1 to regulate rice heading date by finely modulating Ehd1 expression
實(shí)驗(yàn)方法：
OsRE1和 OsRIP1的CDS 分別與PAN580亞細(xì)胞定位載體融合?，綠色熒光蛋白在N端，采用之前所述(zhang et al. ，2011)方法，將GFP融合質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，Pro35s: D53-mcherry 被用作核Marker (zhou et al. ，2013)。用 ZESS LSM880共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
為了確定OsRE1的亞細(xì)胞定位，我們在花椰菜花葉病毒 CaMV 35S啟動子(35S: OsRE1-GFP)的控制下，用 融合了mCherry的D53作為核Marker (zhou?et al. ，2013)。如圖3a 所示，OsRE1-GFP 熒光信號與 D53-mCherry 信號融合良好，提示OsRE1是一種核蛋白。
分析：① Bar值加在Merged視野中，因?yàn)镸erged視野是前三張視野的疊加，最能說明它們的視野大小是一樣的，當(dāng)然也有文獻(xiàn)的做法是每張視野都加同樣大小的Bar值（BiFC的Bar值也加在Merged視野中）。
②通過Bar值我們大致可以知道這個水稻原生質(zhì)體的大小約為35?μm，這是比較成功的轉(zhuǎn)化結(jié)果，其實(shí)水稻的原生質(zhì)體大小為10~38 μm居多，但大的原生質(zhì)體比較容易破，而且可能由于新城代謝原因，15 μm左右的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化表達(dá)效果比較好（對于新手來說），故稱萬建民院士團(tuán)隊有個水稻原生質(zhì)體提取并轉(zhuǎn)化的高手。
③通過這個結(jié)果我們也可以知道，結(jié)果可以不需要放空載PAN580(35S: GFP)的定位結(jié)果，主要原因可能是有Pro35s: D53-mcherry核Marker的純在。
但令我意外的是，這篇文章的BiFC實(shí)驗(yàn)是在煙草中做的，怎么說呢，煙草表達(dá)不是不可以，但煙草對于水稻的研究來說屬于異源表達(dá)，不如就在水稻原生質(zhì)體里做的蛋白互作可信度更高。
2. 基本螺旋-環(huán)-螺旋家族成員 OsBHLH107的過表達(dá)增大水稻的籽粒
亞細(xì)胞定位于BiFC實(shí)驗(yàn)方法：
在瞬時表達(dá)載體 PAN580-GFP 中（在2 × CaMV35S啟動子的控制下），將 OsBHLH107的全長或截短的氨基酸序列與 GFP 融合。水稻原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化如之前所述(Chen et al., 2006)，OsMADS3 (LOC_Os01g10504)(Li et al., 2011) 和D53 (LOC_Os11g01330) (Zhou et al.,2013)被用作核Marker。在 BiFC檢測中，將 OsBHLH107的 CDS 擴(kuò)增并分別克隆到 p2YN?和p2YC? 載體中，分別構(gòu)建p2YN-OsBHLH107和 p2YC-OsBHLH107質(zhì)粒，根據(jù)之前描述轉(zhuǎn)化煙草葉片（Waadt and Kudla,2008）。用 ZESS LSM880共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
為了驗(yàn)證 OsBHLH107的亞細(xì)胞定位模式，我們在水稻原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)了 p35S::OsBHLH107-GFP 載體。正如所料，OsBHLH107-GFP 融合蛋白與細(xì)胞核Marker(OsMADS3-mCherry) (Li et al., 2011)共定位，表明OsBHLH107在細(xì)胞核里行使功能。
分析：① 這里的Bar值加在所有視野中，原生質(zhì)體大小為38 μm左右。OsMADS3 (LOC_Os01g10504)和D53(LOC_Os11g01330)都可以作為核Marker。
結(jié)束語
亞細(xì)胞定位對于一篇好的文章來說是很必要的，所以還是好好重視才行，下次有機(jī)會把自己的操作步驟與大家分享。
