第一節(jié) 顯微鏡檢查

微生物細(xì)胞含大量水分（一般在80%~90%以上），絕大多數(shù)必須染色，才能顯微鏡觀察。

一、染色

（一）染色的基本原理

借助物理因素和化學(xué)因素的作用進(jìn)行

物理因素：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透和吸附作用
化學(xué)因素：細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)

細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH在2~5之間，故在中性、堿性、弱酸性溶液中，<u>菌體蛋白質(zhì)</u>電離后帶負(fù)電荷；而堿性染料電離時(shí)<u>染料離子</u>帶正電。
所以，細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料染色。
染色操作程序：<u>制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢</u>

（二）染色方法

• 單染色法 一種染料、但不能鑒別微生物
• 復(fù)染色法 兩種or兩種以上、協(xié)助鑒別微生物。亦稱鑒別染色法。

1. 單染色法
   一種染色劑、簡(jiǎn)便易行、適于形態(tài)觀察。
   常用堿性染料。使用酸性染料時(shí)、必須降低染液的pH，使其呈現(xiàn)強(qiáng)酸性（低于菌體等電點(diǎn)），讓菌體帶正電荷、才易于染色。

• 石炭酸復(fù)紅染色液：著色快、時(shí)間短、菌體紅色
• 美藍(lán)染色液：著色慢、時(shí)間長(zhǎng)、效果清晰、菌體藍(lán)色
• 草酸銨結(jié)晶染色液：染色迅速、著色深、菌體紫色

2. 革蘭染色法
   廣泛使用的鑒別染色法、1884丹麥Gram創(chuàng)立。
   堿性染料（草酸銨）結(jié)晶紫染色、碘液媒染、<u>95%酒精</u>脫色、堿性番紅 復(fù)染。
   初染、媒染、脫色、復(fù)染四個(gè)步驟。（G+菌體紫色、G-紅色）

• G+：有芽孢的桿菌、多數(shù)球菌、放線菌、真菌
• G-：弧菌、螺旋體、多數(shù)致病性無(wú)芽孢桿菌

主要依據(jù)：

• G+含有<u>核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物、與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢、不易脫色。</u>
• G+菌體<u>等電點(diǎn)比G-低</u>，相同pH下染色、<u>吸附堿性染料很多，因此不易脫去</u>。
• 兩類菌細(xì)胞壁對(duì)<u>結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的通透性</u>也不一致，G+透性小，故不易被脫色。

3. 抗酸染色法
   <u>分枝桿菌屬、細(xì)胞壁含大量脂質(zhì)</u>。
   著色后抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸乙醇的脫色，又稱<u>抗酸桿菌（acid-fast bacilli）</u>
   分枝桿菌-紅色、其他細(xì)菌&背景-藍(lán)色
4. <u>5%石炭酸復(fù)紅染色劑</u>蓋滿痰膜，微火加溫→蒸汽，去火焰，<u>染色5~10分鐘</u>，水洗
5. 加<u>5%鹽酸酒精脫色劑</u>蓋滿痰膜，<u>脫色3~5分鐘</u>，至無(wú)紅色、水洗
6. 加<u>美藍(lán)復(fù)染劑</u>、（直接涂片30秒、集菌涂片1~3分鐘）、水洗、干后鏡檢。
7. 芽孢染色
   <u>孔雀綠 加熱條件下</u>染色，染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽孢內(nèi)，進(jìn)入菌體的染料水洗后脫色、進(jìn)入芽孢的染料很難被水洗脫色，復(fù)染劑染色后、芽孢保留初染劑顏色、菌體和芽孢囊被染成復(fù)染劑顏色。
   芽孢染色操作步驟
   制成菌懸液→<u>孔雀綠染色1分鐘</u>→試管水浴<u>加熱15_{20分鐘</u>→接種環(huán)取加熱染色菌液涂片→干燥→固定→<u>水洗**脫色**</u>→<u>**番紅或稀釋石炭酸復(fù)紅**復(fù)染1}2分鐘</u>→水洗→晾干→油鏡觀察
8. 莢膜染色
   采用負(fù)染色法染莢膜、濕墨水法（較簡(jiǎn)便、適用廣）
   莢膜不著色、在菌體周?chē)室?strong>透明圈。
   由于莢膜含水量在90%以上，染色時(shí)不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。
9. 負(fù)染色法
10. 制片：載玻片、蒸餾水1滴、少量菌體混勻涂布
11. 干燥：晾干or電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干
12. 染色：復(fù)紅染色液染色2~3分鐘
13. 水洗
14. 干燥
15. 涂黑素：一小滴黑素、推片向右一拖、使黑素在染色涂面上成為一薄層、風(fēng)干
16. 鏡檢：先低倍鏡→再高倍鏡

背景灰色、菌體紅色、莢膜無(wú)色透明。

2. 濕墨水法
3. 制菌液：加一滴墨水、少量菌體混合
4. 加蓋玻片：放一蓋玻片于混合液上、在蓋玻片上放一張濾紙、輕壓 吸去多余菌液
5. 鏡檢

背景灰色、菌體較暗、在其周?chē)尸F(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。

6. 鞭毛染色
   基本原理：染色前先用媒染劑處理、讓它沉積在鞭毛上、使鞭毛直徑加粗、然后再染色。常用<u>鍍銀法染色</u>。
   步驟-簡(jiǎn)略：

• 媒染(A)液：飽和硫酸鋁鉀、5%FeCl3、黑色溶液
• 媒染(B)液：5%AgNO3

制片：1滴蒸餾水、少許菌苔、平放干燥
染色：A液染3_{5分鐘→蒸餾水沖洗→殘水瀝干or用B液沖去殘水（**充分洗凈A液、否則背景很臟**）→滴加B液→酒精燈上稍加熱、微冒蒸汽而不干、30}60秒→蒸餾水沖洗、自然干燥
鏡檢：菌體深褐色、鞭毛為褐色

二、顯微鏡檢查

（一）普通光學(xué)顯微鏡

油浸物鏡、觀察完畢、<u>先用擦鏡紙</u>擦去鏡頭上的油、在用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇混合液（乙醚2份、無(wú)水乙醇3份）or二甲苯，擦去殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2~3下（朝一個(gè)方向）
普通光學(xué)顯微鏡<u>不能觀察細(xì)胞和細(xì)菌的亞結(jié)構(gòu)。</u>

（二）暗視野顯微鏡（未染色活細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)、不能細(xì)微結(jié)構(gòu)）

設(shè)計(jì)原理：丁達(dá)爾現(xiàn)象
光源的中央光束被阻擋、散射的光線投入物鏡、整個(gè)視野是黑暗的。
暗視野中觀察到的是被檢物體的衍射光圖像、并非物體本身、所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，（不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)）。用于→未染色標(biāo)本的<u>活的</u>細(xì)菌、真菌，并可觀察活細(xì)胞內(nèi)的線粒體及細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)。觀察螺旋體時(shí)多用暗視野顯微鏡。
暗視野聚光器→顯微鏡的聚光器支架上、顯微鏡燈照明，聚光器和標(biāo)本片之間要加一滴<u>香柏油</u>。目的：避免聚光鏡全反射。

（三）相差顯微鏡（活細(xì)胞、細(xì)微結(jié)構(gòu)）

將光線通過(guò)透明標(biāo)本細(xì)節(jié)產(chǎn)生的光程差（相位差）轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)差的特種顯微鏡。
適用于對(duì)<u>活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)</u>的觀察。
放上綠色濾光片

（四）熒光顯微鏡

高發(fā)光效率的點(diǎn)光源→濾色系統(tǒng)→一定波長(zhǎng)的光<u>（紫外光365nm、紫藍(lán)光420nm）作為激發(fā)光</u>→激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出熒光。
敏感性高、用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。
熒光光源一般采用超高壓汞燈（50~200W）、激發(fā)濾片（紫外、紫色、藍(lán)色、綠色）、阻斷（或壓制）濾光片
按光路區(qū)分

1. 透射式熒光顯微鏡 激發(fā)光源通過(guò)聚光鏡、穿過(guò)標(biāo)本、放大倍數(shù)↑熒光↓
2. 落射式熒光顯微鏡 激發(fā)光從物鏡落射到標(biāo)本表面、放大倍數(shù)↑熒光↑

第二節(jié) 病原細(xì)菌分離

一、傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法

傳統(tǒng)細(xì)菌：指人工培養(yǎng)基上易于增殖的細(xì)菌

（一）標(biāo)本的分離前處理

1. 增菌
2. 冷增菌 耶爾森-低溫下不停止繁殖、4℃
3. 加熱 芽孢桿菌耐熱-炭疽芽孢桿菌、沸水浴15 mins

（二）平板劃線分離技術(shù)

“三段劃線”、目的：使細(xì)菌分散、生長(zhǎng)為單個(gè)菌落、便于挑選目標(biāo)細(xì)菌

（三）分離培養(yǎng)基選擇

1. 高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基or敏感培養(yǎng)基
   目的：為目標(biāo)細(xì)菌提供盡可能完整的營(yíng)養(yǎng)條件、促進(jìn)繁殖
   氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)鹽類、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
2. 鑒別培養(yǎng)基
   常用鑒別物質(zhì)：
3. 染料
4. 特殊的糖、醇類物質(zhì)加酸堿指示劑
5. 顯示目標(biāo)細(xì)菌特殊代謝產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)試劑
6. 選擇培養(yǎng)基
   充分支持目標(biāo)細(xì)菌生長(zhǎng)、盡可能抑制雜菌、特別是限制呈“匐行性”生長(zhǎng)的雜菌（變形桿菌、真菌）
   選擇手段：
7. 限制培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分、采用特殊生長(zhǎng)條件：對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低、條件特殊的致病菌。（霍亂弧菌--堿性蛋白胨培養(yǎng)基）
8. 加入抑菌成分：龍膽紫、膽鹽等
9. 加入抗生素：多粘菌素、兩性霉素B、制霉菌素

（四）菌落識(shí)別與挑取

1. 菌落的肉眼形態(tài)
   炭疽--灰白色、磨砂玻璃狀；鼠疫：生長(zhǎng)慢、灰黃色、隆起
2. 細(xì)菌的顯微形態(tài)
   **炭疽：獅鬃樣菌落；鼠疫：表面粗糙的顆粒狀突起、血瓊脂平板-邊緣帶有“花邊”；支原體--“荷包蛋”狀
3. 挑取菌落
   第二次純分/進(jìn)一步培養(yǎng)鑒定

二、難培養(yǎng)細(xì)菌的分離

類型：

• 營(yíng)養(yǎng)要求高，或需特定成分（如支原體）
• 需要特殊溫度、濕度、pH和氣體條件
• 生長(zhǎng)特別緩慢、培養(yǎng)過(guò)程中防止雜菌污染和過(guò)度生長(zhǎng)難度較大

（一）厭氧菌分離

燭缸、嚴(yán)格的分離操作-處理標(biāo)本開(kāi)始無(wú)氧的手套箱

（二）支原體分離

使用特殊的培養(yǎng)基：添加膽固醇、馬血清、酵母提取物、抗生素等。液體-添加酚紅指示劑
固體培養(yǎng)基、5%CO2、37℃、7日后用60倍低倍鏡 斜投射光觀察是否生長(zhǎng)、一般3周左右長(zhǎng)成菌落。菌落中心陷入平皿生長(zhǎng)、“油煎蛋”樣
支原體菌落堅(jiān)實(shí)、無(wú)法挑取、滅菌刀片切取菌落瓊脂塊→移入液體培養(yǎng)基→棕紅色變?yōu)辄S綠色提示生長(zhǎng)、支原體小→液體培養(yǎng)不會(huì)明顯渾濁
反復(fù)2~3次。

（三）L型分離

L型→細(xì)胞壁缺損的細(xì)菌
在普通滲透壓下、細(xì)胞壁缺損的細(xì)菌會(huì)“漲破”死亡→分離L型的培養(yǎng)基必須高滲透壓。
<u>瓊脂濃度0.5%（0.3_{0.5%半固體、1.5%}2.5%固體）以下的半固體培養(yǎng)基，加馬血清及10%蔗糖維持滲透壓</u>（3%~5%NaCL？）L型可生長(zhǎng)成“油煎蛋”樣細(xì)小菌落。

（四）螺旋體分離

1. 鉤端螺旋體
   血液標(biāo)本→<u>Korthof或EMJH培養(yǎng)管、20_30℃→57 d取培養(yǎng)物</u>暗視野顯微鏡下觀察有無(wú)生長(zhǎng)
   克服雜菌污染，病人尿液、采集前一晚服用<u>碳酸氫鈉（NaHCO3）2~4g，培養(yǎng)基中加入5-氟尿嘧啶or磺胺嘧啶</u>
2. 梅毒螺旋體
   接種<u>兔睪丸or眼前房。氧濃度1.5%、含有棉尾兔上皮細(xì)胞的組織培養(yǎng)基、34~35℃</u>。

（五）立克次體分離

專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌、必須動(dòng)物及細(xì)胞分離
姬姆尼茨、吉姆薩染色

1. 通過(guò)動(dòng)物分離
   除<u>恙蟲(chóng)病選小白鼠、其他立克次體雄性豚鼠</u>。
2. 使用雞胚分離
   <u>5~7日齡雞胚、卵黃囊</u>
3. 細(xì)胞培養(yǎng)
   <u>Vero、L929細(xì)胞</u>、37℃、5%CO2

三、使用動(dòng)物的分離方法

常用動(dòng)物：小鼠、大鼠、豚鼠
注射：皮下、腹腔、靜脈or特殊器官（如顱內(nèi)接種）
已分離的病原菌在保存過(guò)程中突變→喪失致病能力→制成懸液<u>接種于動(dòng)物→重新從動(dòng)物分離出來(lái)→成為完整毒力的培養(yǎng)物</u>，過(guò)去是保存病原菌的常規(guī)做法→菌株的“復(fù)壯”（實(shí)際上是利用動(dòng)物的疾病過(guò)程，將殘留的具有毒力的致病細(xì)菌從大量無(wú)毒力的突變細(xì)菌中重新分離出來(lái)）

第三節(jié) 病原細(xì)菌鑒定

一、生化特征鑒定方法

二、特殊反應(yīng)鑒定方法

最常用-革蘭染色、特殊反應(yīng)-莢膜腫脹試驗(yàn)等

三、噬菌體鑒定方法

霍亂弧菌鑒定：噬菌體-生物學(xué)分型

四、其他特殊的鑒定方法

單克隆抗體檢測(cè)特異性抗原：凝集試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光試驗(yàn)、膠體金免疫吸附試驗(yàn)等

五、分型

最常用實(shí)驗(yàn)同四

六、特異性核酸片段鑒定

比抗原檢測(cè)敏感性更高

• 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)→PCR：普通PCR、套式PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
• 探針雜交
• 基因芯片雜交

七、病原毒力測(cè)定

通常使用動(dòng)物試驗(yàn)。半數(shù)致死量為指標(biāo)。

第四節(jié) 分離后細(xì)菌的培養(yǎng)和保存

一、純分后細(xì)菌的培養(yǎng)方法

每一次分離過(guò)程、獲得的純培養(yǎng)物→稱作一“株”該種細(xì)菌
所保存的培養(yǎng)物→稱為該種細(xì)菌的“菌種”。
將細(xì)菌增殖到所需數(shù)量→這一過(guò)程稱為“培養(yǎng)”。

• 細(xì)菌數(shù)量不大時(shí)，固體or半固體培養(yǎng)基
  • 用于遺傳學(xué)鑒定：特別強(qiáng)調(diào)從單獨(dú)菌落開(kāi)始，固體的平板培養(yǎng)基
  • 一般的細(xì)菌鑒定：常用斜面。
  • 短期保存培養(yǎng)物：高層？？半固體培養(yǎng)基→試管→接種針穿刺到瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)。不容易干燥、不容易污染
• 提取細(xì)菌成分，需要較大培養(yǎng)量
  • 固體培養(yǎng)基、<u>在“茄瓶”or“克氏瓶”中進(jìn)行、一種放大了的斜面。</u>
  • 液體培養(yǎng)基、燒瓶中振蕩培養(yǎng)、需氧細(xì)菌使用較大燒瓶、<u>培養(yǎng)基只占燒瓶容量的10%~15%</u>，氣體充分交換。
• 大量培養(yǎng)、使用“發(fā)酵罐”：一定容積的培養(yǎng)液、最大數(shù)量的細(xì)菌
  恒溫加熱、配有加液口、攪拌器、通氣管道

二、菌種保存方式

• 早期--傳代

• 目前--多數(shù)采取“凍干”，<u>至少保持20年</u>。穩(wěn)定劑：脫脂乳or蔗糖
  缺點(diǎn)

  1. 一支只能使用1次
  2. 凍干的菌種，必須經(jīng)過(guò)“復(fù)蘇”。（第一次培養(yǎng)時(shí)總是生長(zhǎng)不良，至少一次傳代）

• 低溫保存 穩(wěn)定劑：甘油
  <u>不可使解凍、幾乎永久性保持、即作保存菌株又作工作菌種</u>

  • -20℃ 緩沖液加甘油60%濃度、呈黏稠的液體狀，常規(guī)挑取
  • -80℃ 加15%~20%甘油、凍結(jié)成硬冰激凌狀、竹簽刮取冰屑