1：ChIP-Seq概述
??染色質(zhì)免疫沉淀測序技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationfollowedby sequencing，ChIP-Seq)是近年來新興的將染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitation，ChIP) 與新一代測序技術(shù)相結(jié)合，在全基因組范圍內(nèi)分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcriptionfactorbindingsites， TFBS)、組蛋白修飾(histonemodification)、核小體定位(nucleosomepositioning)和 DNA 甲基化(DNA methylation)的高通量方法。
(1).ChIP-Seq原理:
??ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)包括染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和高通量測序兩個(gè)部分，其基本原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段；然后構(gòu)建測序文庫，采用新一代測序技術(shù)對(duì)富集得到的 DNA 片段進(jìn)行高通量測序；最后通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子等 DNA 結(jié)合蛋白相互作用的DNA 區(qū)段信息 。
(2).ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)流程簡圖
2.ChIP技術(shù)
??根據(jù)在 ChIP 過程中是否需要對(duì)蛋白質(zhì) -DNA 進(jìn)行交聯(lián)處 理，ChIP 可分為 X-ChIP和 N-ChIP兩類，其中 X 表示“交聯(lián)”(crosslinking)，N 表示“自然狀態(tài)”(native)．
（1）X-Chip:主要適用于結(jié)合力較弱的 DNA- 蛋白質(zhì)相互作用的研究：首先，通過福爾馬林處理處于生長狀態(tài)下的活細(xì)胞，使 DNA 結(jié)合蛋白與 DNA 緊密交聯(lián)；然后，采用超聲儀超聲處理染色質(zhì)，將染色質(zhì)隨機(jī)打斷為 200～1000bp 的小片段；接著，采用目的蛋白特異性的抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合體，富集目的蛋白靶定的 DNA 片段；最后，解交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合體，獲取純凈的 DNA 片段．
（2）N-ChIP:主要用于組蛋白修飾、核小體定位的研究．由于組蛋白與 DNA 之間的作用力較強(qiáng)，因此在 N-ChIP 實(shí)驗(yàn)中不需要采用福爾馬林處理活細(xì)胞，而是讓 DNA 結(jié)合蛋白與 DNA 之間保持一種自然狀態(tài)，然后，采用一種微球菌核酸酶(micrococcalnuclease，MNase)對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行消化．在染色質(zhì)免疫沉淀過程中，抗體的質(zhì)量和對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的。
3.高通量測序技術(shù)
??高通量測序的工具主要有羅氏公司(Roche)的 454 測序儀 (RocheGSFLXsequencer)、Illumina 公司推出的基因組分析平臺(tái)(包括 HiSeq2000、HiSeq1000、Solexa GenomeAnalyzerIIx)、ABI(AppliedBiosystem)公司研發(fā)的 SOLiD 測序儀(包括 SOLiD3.0、SOLiD4.0) 和 HelicosBiosciences 公司的單分子測序儀 (HeliScope)，其中采用 IlluminaSolexa 基因組分析平臺(tái)進(jìn)行ChIP-Seq已有較多文獻(xiàn)報(bào)道。
4. ChIP-seq與 ChIP-chip技術(shù)特點(diǎn)對(duì)比
??ChIP-seq 與 ChIP-chip 都是高通量研究蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的方法，但 ChIP-seq 具有很多 ChIP-chip 技術(shù)無法媲美的優(yōu)勢。具體如下：
- ChIP-seq 最大的優(yōu)勢就是可以精確到單個(gè)核苷酸的分辨率。
- ChIP-seq 減少了 Chip-chip 雜交過程中產(chǎn)生的噪音。
- 由于芯片信號(hào)識(shí)別過程中弱信號(hào)常常會(huì)被丟棄而強(qiáng)信號(hào)會(huì)飽和，因此通過 ChIP-chip 獲得的信號(hào)強(qiáng)度往往不是線性的， 其信號(hào)強(qiáng)度的量程限定在一定范圍內(nèi)，而 ChIP-seq 有效地避免了這種情況。
- ChIP-seq 的顯著優(yōu)勢就是基因組覆蓋范圍 不受固定在微陣列上探針的限制，這對(duì)分析基因組 上的重復(fù)區(qū)域(如微衛(wèi)星序列)尤其重要。
- ......
5. ChIP-seq的實(shí)際應(yīng)用
(1)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)研究:
??轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor，TF)是一類很重 要的蛋白質(zhì)分子，其可以通過靶定調(diào)控一些下游效 應(yīng)分子，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮強(qiáng)大的生物學(xué)作用.全基因組范圍內(nèi)明確這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)是揭示這些轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能和機(jī)制的基礎(chǔ)，同時(shí)也是繪制基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不可缺少的部分。
(2)組蛋白修飾研究:
??組蛋白是存在于真核生物染色質(zhì)中的一組進(jìn)化上非常保守的堿性蛋白質(zhì)，分為 H1、H2A、H2B、 H3、H45種類型，通常情況下，這些結(jié)合在 DNA 上的組蛋白常常被修飾，修飾方式如甲基化、乙?；⒘姿峄?。目前已有的大量研究表明組蛋白修飾主要參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且不同的組蛋白修飾其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用不同；同時(shí)，組蛋白修飾也與 DNA 損傷修復(fù)相關(guān)。
(3)核小體定位研究：
??核小體(nucleosome)是構(gòu)成真核生物染色質(zhì)的 基本結(jié)構(gòu)單位，由 DNA 纏繞在組蛋白八聚體上構(gòu) 成。核小體定位能影響染色質(zhì)的包裝狀態(tài)和 DNA 的開放程度，已被證實(shí)在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、 DNA 復(fù)制與修復(fù)、可變剪切等過程中扮演著重要的角色。
(4) DNA 甲基化研究：
??DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的一個(gè)重要機(jī)制，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用。大量研究表明 DNA 甲基化修飾在胚胎發(fā)育、基因組印 記、腫瘤發(fā)生、基因調(diào)控以及轉(zhuǎn)座子沉默等生物過程中發(fā)揮著重要作用。
(5)其他方面
??ChIP-seq 可以通過捕獲發(fā)揮介導(dǎo)作用的蛋白質(zhì)進(jìn)而揭示高級(jí)染色體結(jié)構(gòu)；以及端粒的研究等。
