Cell | 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示肝實質(zhì)細(xì)胞及肺實質(zhì)細(xì)胞的早期細(xì)胞譜系
原文題目：Single-Cell Transcriptomics Reveals Early Emergence of Liver Parenchymal and Nonparenchymal Cell Lineages
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發(fā)表時間：2020年10月
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影響因子：38.6
摘要：加拿大特里?？怂箤嶒炇乙粓F隊，揭示單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了肝實質(zhì)和非實質(zhì)細(xì)胞譜系的早期出現(xiàn)。
早期肝臟的細(xì)胞復(fù)雜性和規(guī)模限制了對其器官形成過程中出現(xiàn)的分析。為了解決這些問題，作者分析了從胚胎E7.5天到E10.5天的45334個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。該研究的數(shù)據(jù)詳細(xì)說明了血管內(nèi)皮和血竇內(nèi)皮的差異，包括E8.75天的血竇內(nèi)皮獨特轉(zhuǎn)錄譜。該研究描述了兩種不同的間皮細(xì)胞類型以及早期肝星狀細(xì)胞，并揭示了這些細(xì)胞群的不同時空分布。該研究捕獲了肝母細(xì)胞特異性和遷移的轉(zhuǎn)錄譜，包括肝充質(zhì)細(xì)胞類型的出現(xiàn)和肝母細(xì)胞集體遷移的證據(jù)。
建庫及測序平臺：10X Genomics，hromium Single Cell 30 Reagent v2 Chemistry Kit，Illumina Novaseq 6000 system
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數(shù)據(jù)質(zhì)控：Cell Ranger version 2.1.0
降維聚類、基因表達(dá)，差異基因分析等：scran、scater、Seurat
去批次：MNN，Harmony
細(xì)胞通訊分析：CellphoneDB、NicheNet（深入解析細(xì)胞中的基因表達(dá)是如何被相互作用的細(xì)胞所調(diào)節(jié)的）
結(jié)果：
1.在肝發(fā)生中的細(xì)胞圖譜
作者分析了從胚胎發(fā)生第7.5天到第10.5天的內(nèi)胚層及肝組織。為了富集實質(zhì)性和非實質(zhì)性肝細(xì)胞，E7.5和E8.75的內(nèi)胚層、中胚層，E9.5和E10.5的肝芽通過細(xì)胞分選進行了剔除。質(zhì)控后獲得了45334個細(xì)胞（15個樣本），細(xì)胞表達(dá)中位值為4190個基因。通過聚類獲得15個亞群，并通過鑒定marker基因?qū)ζ溥M行了注釋，包括內(nèi)胚層、間充質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞系和造血細(xì)胞等。細(xì)胞注釋用先前發(fā)表的文章進行了驗證。
為了更清楚地了解肝細(xì)胞類型的產(chǎn)生，作者進一步對內(nèi)胚層、間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞系分別進行了研究。這些細(xì)胞系單獨進行了可視化，使用Palantir包進一步分析，在發(fā)育層面重建細(xì)胞系的關(guān)系。
2.肝竇和血管內(nèi)皮細(xì)胞在E9.5由共同的內(nèi)皮祖細(xì)胞分化而來
該研究分析了從E7.5到E10.5的2,066個內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。聚類后得到4個亞群，分別為血管母細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（HSECs）。
為了詳細(xì)說明造血細(xì)胞和來自血管母細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞譜系之間的差異，作者使用Palantir包進行了擬時序分析來查看他們潛在的發(fā)展進化關(guān)系。
作者選擇實心箭頭處為起始點，選擇了空心箭頭處為三個終末狀態(tài)，并計算了到達(dá)這些末端狀態(tài)時每個軌跡的分化潛能和基因表達(dá)趨勢。分化潛能在血管母細(xì)胞簇內(nèi)最高；然而，內(nèi)皮細(xì)胞和HSEC簇之間存在局部最大值，這表明HSEC中存在第二個cell fate decision（B黑色箭頭）。通過對不同細(xì)胞類型特性相關(guān)的調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的分析，作者闡述了四種細(xì)胞類型間的分化發(fā)展。
3.早期肝臟中，橫隔和肝間充質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性
關(guān)于間充質(zhì)（包括STM、間皮和肝星狀細(xì)胞）的研究不多。因此，對于在早期肝臟中涌現(xiàn)的間充質(zhì)細(xì)胞群體的多樣性了解甚少。該研究從E8.75、E9.5和E10.5中計算分離了3691個肝間充質(zhì)細(xì)胞，并基于聚類和差異基因表達(dá)分析鑒定了5個不同的亞群。對每個細(xì)胞群進行的單獨描述和研究，部分用免疫熒光進行了驗證。
（包括每個亞群特異性表達(dá)的基因，來自哪一個時間的組織，免疫熒光驗證時處于組織的什么位置等）
4.早期肝臟中存在肝充質(zhì)雜交祖細(xì)胞
胚胎肝形成于后腹前腸內(nèi)胚層，它遷移侵入STM。為了探究這一轉(zhuǎn)變，該研究計算分離了從E7.5到E10.5測序的2332個肝祖細(xì)胞，并使用聚類和差異表達(dá)分析來識別四種不同的細(xì)胞狀態(tài)。
與第三部分研究類似，作者闡述了每個細(xì)胞亞群的特異性基因表達(dá)，相關(guān)的功能，時期來源等。
為了探索細(xì)胞特性的轉(zhuǎn)變，作者計算了肝臟、間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞特異性基因平均值表達(dá)譜（圖C）。根據(jù)對上皮和間充質(zhì)基因譜結(jié)果的分析，早期肝實質(zhì)內(nèi)存在一種上皮-間充質(zhì)混合祖細(xì)胞類型，表達(dá)與肝間質(zhì)和肝間充質(zhì)特性相關(guān)的基因。
5.肝母細(xì)胞和肝間充質(zhì)通過不同的遷移機制出現(xiàn)
作者用Palantir推測兩種細(xì)胞的分化軌跡，根據(jù)不同的基因的激活闡述了兩種細(xì)胞類型不同的遷移機制。
（實心箭頭為分化起點內(nèi)胚層細(xì)胞，兩個終末狀態(tài)代表肝母細(xì)胞和肝間充質(zhì)細(xì)胞。假時間的基因趨勢顯示內(nèi)胚層標(biāo)記物如Epcam和Foxa1的下調(diào)，以及與后前腸特征相關(guān)的基因的激活，如Pyy和Onecut1。在這兩個實驗中，我們看到了與肝細(xì)胞遷移相關(guān)的基因的激活，包括Hhex和Foxa3，以及肝臟特性，如Hnf4a和Afp（圖B）。有趣的是，在肝母細(xì)胞終末狀態(tài)的細(xì)胞中，我們看到了Foxa1的重新激活以及與肝臟特性相關(guān)的基因的維持；然而，在肝間充質(zhì)軌跡中，我們沒有看到它們的持續(xù)表達(dá)（圖B）。相反，與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的基因，如Snai1、Snai2和Zeb2被激活（圖B）。）
6.原始血竇的信號通路
為了探究在血竇生成過程中的胞間相互作用，該研究用CellPhoneDB來確認(rèn)endothelial, HSEC, hepatoblast,HSC, 和hepatomesenchymal lineages間潛在的通路。
正如預(yù)期的那樣，作者看到明顯的血管內(nèi)皮生長因子信號，以及肝母細(xì)胞和HSC之間的PDGF信號（圖A）。接下來，作者對于各種已經(jīng)發(fā)表的和新發(fā)現(xiàn)的信號通路進行了細(xì)致的描述，闡述了其已知和預(yù)測的功能和作用。
