【上一篇為大家介紹了TASS的生物學(xué)功能以及研究方法，本篇繼續(xù)為大家介紹IV分泌系統(tǒng)的效應(yīng)底物以及轉(zhuǎn)移方式】

上海唯那生物：Type IV secretion system, T4SS知識(shí)介紹1zhuanlan.zhihu.com

結(jié)構(gòu)組成

T4SS最少由一組保守的亞基組成。在革蘭氏陰性菌中，需要約12個(gè)亞基來(lái)構(gòu)建功能齊全的“minimized”系統(tǒng)。根據(jù)來(lái)自典型根癌土壤桿菌VirB/VirD4 T4SS的T4SS超家族(T4SS superfamily )的統(tǒng)一命名法，這些被命名為VirB1-VirB11和VirD4.

①?三種ATP酶（VirD4，VirB4，VirB11）構(gòu)成位于易位通道底部的細(xì)胞質(zhì)能量中心，也就是定位于內(nèi)膜并作為為系統(tǒng)供電的ATP酶，在這些ATP酶中，VirD4在進(jìn)入轉(zhuǎn)移通道之前充當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)底物結(jié)合的受體，轉(zhuǎn)運(yùn)的 DNA 呈遞給分泌系統(tǒng)的其他組分。

② 通道本身由兩個(gè)子組件組成，一個(gè)組件跨越內(nèi)膜（inner membrane,IM），另一個(gè)組件位于周質(zhì)和外膜（outer membrane ,OM）中。

③?IM復(fù)合物（IM complex,IMC）最少由VirB3，VirB6，VirB8和VirB10的N-末端區(qū)域組成。與通道穩(wěn)定結(jié)合的VirB4 ATP酶也被認(rèn)為是IMC的一部分。

④ IMC通過(guò)莖或圓柱體連接到外膜核心復(fù)合物（outer membrane core complex,OMCC），其最小程度地由脂蛋白VirB7，VirB9和VirB10的C末端( C-terminal)結(jié)構(gòu)域組成.

T4SS底物和轉(zhuǎn)移信號(hào) (T4SS substrates and translocation signals)

關(guān)鍵詞：Dtr proteins（MOB） 、relaxosome、 IV型偶聯(lián)蛋白（type IV coupling proteins，T4CP）、轉(zhuǎn)移信號(hào)（translocation signals，TSs）

VirD4 receptors and substrate docking

VirD4受體幾乎與所有的T4SSs相關(guān)；少數(shù)缺乏VirD4亞單位的系統(tǒng)似乎只在抗原可變（antigenically-variable）菌毛的形成過(guò)程或從周質(zhì)向T4SS輸出底物中起作用。

R388編碼的TrwB是T4CP超家族的結(jié)構(gòu)原型。根據(jù)TrwB的結(jié)構(gòu)和其他生化證據(jù)，VirD4受體被認(rèn)為是具有N末端跨膜結(jié)構(gòu)域（NTD）、保守胞質(zhì)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）和與底物結(jié)合有關(guān)的序列變量全α結(jié)構(gòu)域（AAD）的同六聚體。

一些T4CPs比TrwB（507個(gè)殘基）大得多，這是由于在一個(gè)或兩個(gè)末端存在序列變量擴(kuò)展。DotL與嗜肺鏈球菌T4SSDot/Icm相關(guān)，目前是這些較大受體的最佳表征代表。DotL具有約200個(gè)殘基的C-末端結(jié)構(gòu)域（CTD），該結(jié)構(gòu)域與T4SSDot/Icm轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)子子所需的銜接蛋白IcmS和IcmW結(jié)合。

在過(guò)去三年中，在確定銜接子(adaptors)和DotL的CTD對(duì)效應(yīng)子募集的作用方面取得了重大進(jìn)展。首先，兩組報(bào)告了DotL CTD(IcmS and IcmW 與 DotN and LvgA)的晶體結(jié)構(gòu)。DotN，IcmW，IcmS和LvgA從CTD的N端到C端連續(xù)結(jié)合。在假設(shè)原子模型中，DotL全復(fù)合物由與鐘形 CTD /adaptor復(fù)合物連接的類TrwB同六聚體組成，其被稱為底物受體或識(shí)別模塊。在該模型的背景下，通過(guò)與不同的銜接蛋白接觸，大多數(shù)或所有效應(yīng)蛋白被募集到DotL T4CP中。

光交聯(lián)測(cè)定（photocrosslinking assays）的結(jié)果證實(shí)效應(yīng)子與IcmS/IcmW異二聚體的細(xì)長(zhǎng)疏水表面接觸。此外，兩組現(xiàn)已報(bào)道了DotL/銜接子-效應(yīng)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。在一項(xiàng)研究中，提出了與效應(yīng)物VpdB，SetA，PieA或SidH結(jié)合的DotL/IcmS/IcmW/LvgA復(fù)合物的原子結(jié)構(gòu)。

值得注意的是，VpdB的~130個(gè)殘基的C-末端片段由5個(gè)α-螺旋組成，其中a1與LvgA的疏水口袋形成特異性和廣泛的接觸，并且a2-a5形成弱結(jié)合LvgA的四螺旋束。SetA，PieA和SidH的C-末端基序類似地結(jié)合LvgA的疏水口袋。在LvgA疏水口袋的VpdB和SidH（但不是SetA或PieA）的α-螺旋中鑒定出FxxxLxxxK基序。在生物信息學(xué)篩選中，由嗜肺軍團(tuán)菌菌株P(guān)hiladelphia-1編碼的2930種蛋白質(zhì)中的257種攜帶該基序，這些46種屬于T4SSDot/Icm的已知效應(yīng)物庫(kù)。因此，該FxxxLxxxK基序可能構(gòu)成用于介導(dǎo)與LvgA的特定接觸的大部分Dot/Icm效應(yīng)子的先前未識(shí)別的TS。

第二項(xiàng)研究，DotL/受體復(fù)合物的純化產(chǎn)生與DotN，IcmS，IcmW和LvgA結(jié)合的DotL，以及DotM和兩種先前未知的Dot蛋白DotY和DotZ。建模產(chǎn)生了DotL同六聚體/受體（homohexamer/receptor ）模塊的結(jié)構(gòu)，依托于DotM而非IcmS、IcmW或LvgA進(jìn)行轉(zhuǎn)移的第二效應(yīng)子集的招募機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。這些效應(yīng)子攜帶上述E-嵌段基序，并且與DotM的E-嵌段接觸的建模揭示了效應(yīng)子與DotL/受體復(fù)合物結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)?？傊?，這些最新發(fā)現(xiàn)大大提高了我們對(duì)T4SSDot/Icm通道如何將大量帶有不同TSs的效應(yīng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)移的理解。

在結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)分泌底物后，VirD4受體如何介導(dǎo)穿過(guò)內(nèi)膜或細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移？事實(shí)上，這仍然是IV型分泌最不了解的方面之一。根據(jù)一個(gè)模型，VirD4結(jié)合并直接將底物穿梭到周質(zhì)，在那里它們進(jìn)入VirB通道以通過(guò)細(xì)胞外部?；蛘?，VirD4募集底物，但隨后與VirB4和VirB11 ATP酶協(xié)調(diào)以處理并通過(guò)跨越整個(gè)細(xì)胞包膜的VirB通道遞送它們。對(duì)這兩種模型都有實(shí)驗(yàn)支持，并且由于還沒(méi)有研究可視化由與VirB通道結(jié)合的VirD4六聚體組成的完整T4SS，所以區(qū)分它們是復(fù)雜的。事實(shí)上，二聚體或未指定形式的VirD4亞基顯示與同源T4SS結(jié)合，但不知道這些機(jī)制是否能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移。實(shí)際上，有大量證據(jù)表明，T4SS在感測(cè)到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)（例如底物對(duì)接和ATP能量消耗）以及細(xì)胞外信號(hào)（例如靶細(xì)胞結(jié)合）后會(huì)經(jīng)歷后期組裝或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步定義這種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信號(hào)如何調(diào)節(jié)通道組裝動(dòng)力學(xué)和底物流動(dòng)仍然是進(jìn)一步探索的令人興奮的領(lǐng)域。

效應(yīng)蛋白

Translocation signals，TSs

TSs定義為通過(guò)效應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)識(shí)別蛋白質(zhì)底物，早期，在C末端發(fā)現(xiàn)了兩種TSs，一種由帶正電荷的簇組成，另一種由疏水殘基組成。許多效應(yīng)子攜帶這樣的TSs，但實(shí)際上，不同效應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體識(shí)別的TSs之間存在很大差異，如下所示。

首先，在2015年，C.Farah及其同事在黃單胞菌（Xanthomonas citri）中發(fā)現(xiàn)了T4SSs亞家族，該亞家族通過(guò)蛋白質(zhì)毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)相鄰細(xì)菌的殺滅。所有這些效應(yīng)毒素都攜帶C-近端TSs，由約120個(gè)殘基組成，稱為XVIPCD（Xanthomonas VirD4-interacting protein conserved domain)。?X.citri VirB/VirD4 T4SS的效應(yīng)子最初被識(shí)別是在與VirD4結(jié)合的蛋白質(zhì)。然而，作為生物信息學(xué)篩選的結(jié)果，帶有XVIPCD基序的候選效應(yīng)子列表超過(guò)了數(shù)百個(gè)；分散在許多物種中，以黃單胞菌和其他變形桿菌的順序排列。XVIPCD的特征在于N-末端區(qū)域和富含Gln的C-末端區(qū)域中的一些保守基序，但尚未指定effector - VirD4 相互作用的性質(zhì)。

在Bartonella spp中，BEP（Bartonella effector proteins）效應(yīng)蛋白在感染期間通過(guò)VirB/VirD4 T4SS遞送到真核細(xì)胞中。Bep具有稱為BID（Bep intracellular delivery）結(jié)構(gòu)域的C近端TS。BID結(jié)構(gòu)域是序列可變的，但采用由延伸的4-螺旋束組成的保守結(jié)構(gòu)折疊，其有趣地使人聯(lián)想到由TraM和上述其他Dtr蛋白攜帶的C-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)折疊也涉及VirD4結(jié)合，但有趣的是，給定的效應(yīng)子可以具有分布在整個(gè)Bep中的多個(gè)BID結(jié)構(gòu)域。此外，BID結(jié)構(gòu)域可通過(guò)結(jié)合和改變蛋白質(zhì)功能在真核宿主細(xì)胞中賦予效應(yīng)子功能。例如，BepA的BID1結(jié)構(gòu)域通過(guò)結(jié)合人腺苷酸環(huán)化酶的催化亞基C2以增強(qiáng)cAMP產(chǎn)生來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)人內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。因此，至少有一些BID結(jié)構(gòu)域進(jìn)化出雙重作用，即作為TSs被VirD4受體識(shí)別，以及通過(guò)結(jié)合真核細(xì)胞靶來(lái)幫助感染的效應(yīng)子。

嗜肺軍團(tuán)菌Dot/Icm T4SS的早期研究鑒定了許多轉(zhuǎn)移效應(yīng)子（translocated effectors），其含有由短極性和帶負(fù)電荷的氨基酸組成的C-末端TSs。生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)方法的組合進(jìn)一步鑒定了至少100個(gè)Dot/Icm效應(yīng)子，其在C末端的17至10個(gè)殘基內(nèi)帶有谷氨酸殘基簇（E嵌段基序，the E block motif），并且在末端附近具有一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸。然而，一些具有the E block motif的效應(yīng)子以及缺乏該基序的其他效應(yīng)子的易位可以通過(guò)銜接蛋白如iCM和IcmW正向或負(fù)向調(diào)節(jié)。Dot/Icm效應(yīng)子至少有三種方式與T4SSDot/Icm建立關(guān)系，E嵌段基序，E嵌段基序與銜接子的結(jié)合，或通過(guò)結(jié)合銜接子以及可能除E嵌段基序之外的TS?，F(xiàn)在已經(jīng)描述了通過(guò)與一種或多種銜接蛋白的特異性接觸將潛在的大量效應(yīng)子進(jìn)入到T4SSDot/Icm通道。

效應(yīng)DNA分子

Relaxosome - VirD4 (T4CP) interactions

T4SS通道將底物遞送穿過(guò)細(xì)胞膜，但它必須首先將這些底物輸送到細(xì)胞質(zhì)入口。通過(guò)DNA轉(zhuǎn)移和復(fù)制蛋白（DNA transfer and replication proteins，Dtr proteins）的將MGE向同源接合或“mating”通道的聚集，Dtr proteins結(jié)合轉(zhuǎn)移起點(diǎn)（origin-of-transfer，oriT）序列以形成松弛體（relaxosome）。

以原子分辨率的技術(shù)解決了F質(zhì)粒編碼的TraI松弛酶與其oriT靶序列的相互作用。值得注意的是，TraI含有兩個(gè)轉(zhuǎn)移信號(hào)（translocation signals，TSs），其序列與由在R388，R6112和pKM101質(zhì)粒轉(zhuǎn)移中起作用的松弛酶攜帶的TSs相似。指定為TSA和TSB（Translocation Signals A and B）的這些信號(hào)不位于F編碼的TraI或相關(guān)松弛酶的N或C末端，如分泌蛋白的特征性情況；相反，這兩個(gè)TSs映射到C近端解旋酶結(jié)構(gòu)域，特別是在SF1A/B解旋酶結(jié)構(gòu)折疊的2B/2B樣亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)。這些TSs可能有助于松弛體與同源VirD4受體（IV型偶聯(lián)蛋白（ type IV coupling proteins，T4CP））的結(jié)合，但這些相互作用的細(xì)節(jié)尚不可用。

目前的情況是，許多松弛體組分，包括松弛酶，Dtr因子，甚至轉(zhuǎn)移DNA（translocated DNA），必須結(jié)合VirD4， T4CP才能進(jìn)行特異性和有效的接合DNA轉(zhuǎn)移。

IV型偶聯(lián)蛋白（type IV coupling proteins，T4CP）

IV型偶聯(lián)蛋白是異質(zhì)蛋白家族，具有保守的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-Binding Domain ，NBD）。幾乎所有的T4CP都由TMD和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含NBD，全α結(jié)構(gòu)域（all-alpha domain ，AAD），在某些情況下還包含C-末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）。根據(jù)域的體系結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，T4CP分到五個(gè)子家族。

VirD4-Type

這是T4CP的第一個(gè)描述和研究最多的亞家族。其名稱由根癌土壤桿菌T質(zhì)粒（VirD4At）的T4CP給出。TrwBR388是T4CP家族的原型，包含在這個(gè)VirD4型子家族中。VirD4型亞家族包括500-750個(gè)殘基的膜蛋白，其在N-末端顯示至少兩個(gè)跨膜螺旋。它們之間的序列同一性較低（約15–20%）。

TraG-J對(duì)

這些是與VirD4型T4CP具有相似結(jié)構(gòu)的膜蛋白，長(zhǎng)度約為700個(gè)殘基，周質(zhì)結(jié)構(gòu)域較短。它們之間呈現(xiàn)更高的序列相似性，并且像VirD4型T4CP一樣，它們可以在功能上互換。它們需要膜蛋白TraJ相互作用，才可以以執(zhí)行其功能。TraJ樣蛋白的長(zhǎng)度約為200個(gè)殘基，最多可有5個(gè)跨膜螺旋。

T4CP缺乏TMD

這個(gè)亞家族的成員沒(méi)有TMD（這個(gè)TMD對(duì)于大多數(shù)T4CP的功能是必不可少的）。然而，這些蛋白質(zhì)中的一些與小膜蛋白相互作用，形成類似于VirD4型T4CP的復(fù)合物。該亞家族中研究最多的兩種蛋白質(zhì)是TraiJPIP501（以前稱為Orf10pIP501）和TraIpIP501（以前稱為Orf9pIP501）

FtsK型T4CP

ssDNA-SpoIIIE/FtsK的轉(zhuǎn)位酶與T4CPs的結(jié)構(gòu)具有相似性。在FtsK型T4CP的情況下，這種相似性增加。FtsK型T4CP具有超過(guò)750個(gè)殘基，并且?guī)讉€(gè)TMD通過(guò)大的接頭序列與NBD分開。盡管它們不顯示任何AAD，但它們通常具有用于ATP結(jié)合和水解的額外結(jié)構(gòu)域。

跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain):N-末端顯示跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD）

對(duì)于VirD4型T4CP，TMD對(duì)于體內(nèi)接合是必需的。該結(jié)構(gòu)域參與T4CP和VirB10蛋白之間的相互作用，這對(duì)于T4SS的激活至關(guān)重要。此外，TMD對(duì)于蛋白質(zhì)寡聚化至關(guān)重要，因?yàn)樗祟愡^(guò)程的關(guān)鍵殘基。TMD由α螺旋形成，并包含T4SS相互作用和T4CP功能必不可少的周質(zhì)環(huán)。

TrwBR388的TMD是最廣泛研究的。據(jù)報(bào)道（i）逐步消除TMD元件導(dǎo)致DNA轉(zhuǎn)移的頻率降低；和（ii）缺乏TMD的突變蛋白（TrwBΔN70）將導(dǎo)致DNA失去轉(zhuǎn)移活性。

TMD可能在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有調(diào)節(jié)功能。例如：通過(guò)紅外光譜學(xué)分析研究TMD對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，觀察到TrwBR388在變性條件下（即低離子力，離液劑的存在，高溫）比TrwB N70更穩(wěn)定，因此表明TMD有助于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的更緊湊和有序折疊；TMD也對(duì)核苷酸結(jié)合活性有影響，野生型蛋白對(duì)所有核苷酸的結(jié)合親和力較低，但對(duì)嘌呤核苷酸三磷酸的特異性較高。

TMD在T4CP中顯示出多樣化的序列。盡管對(duì)VirD4型T4CP的活性至關(guān)重要，但缺乏TMD的T4CP能夠完成其同源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。

胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (Cytosolic domain):

核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-Binding Domain ，NBD） 和全α結(jié)構(gòu)域（all-alpha domain ，AAD）

NBD是最保守的域，存在于所有的T4CP中。該域具有兩個(gè) motifs；第一個(gè)基序，即P環(huán)或Walker A，結(jié)合磷酸化的β和γ核苷酸。P環(huán)基序通常表示為G-x（4）-GK-（TS），其中x可以是任何氨基酸，富含甘氨酸，并具有保守的賴氨酸，其后是絲氨酸或蘇氨酸。P環(huán)基序存在于許多ATP或GTP結(jié)合蛋白中，例如ATP合酶，肌球蛋白，腺苷酸環(huán)化酶和ABC蛋白家族的α和β亞基。

第二個(gè)基序稱為Walker B，其序列表示為（RK）xxxGxxx-LhhhDE，其中x表示任何氨基酸，h表示疏水性氨基酸。拓?fù)渖?，NBD位于膜附近，而在結(jié)構(gòu)上，它是由被α螺旋包圍的扭曲的β-折疊形成的。這種構(gòu)象類似于FtsK蛋白的β結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)FtsK蛋白是一種在細(xì)胞分裂過(guò)程中驅(qū)動(dòng)DNA穿過(guò)膜的膜蛋白驅(qū)動(dòng)器。NBD對(duì)于T4CP的體內(nèi)活性至關(guān)重要。實(shí)際上，實(shí)際上，Walker A突變體無(wú)法完成結(jié)合，這可能是由于缺乏ATPase活性。缺乏ATPase活性似乎并未影響突變蛋白的其他特征，例如細(xì)胞位置，核苷酸結(jié)合親和力以及與底物的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，T4CP功能可能發(fā)生在核苷酸和底物結(jié)合事件之后。

全α結(jié)構(gòu)域（all-alpha domain ，AAD）

AAD面向細(xì)胞質(zhì)并呈現(xiàn)可變大小，序列和折疊模式。該結(jié)構(gòu)域也存在于RecA家族的許多蛋白質(zhì)中。在T4CPs中AAD會(huì)阻斷NBD，構(gòu)象改變后可能參與DNA結(jié)合。此外，存在于TrwBR388的AAD中的六個(gè)α-螺旋顯示出與TraMF的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似的拓?fù)涮卣?，TraMF是與T4CPs相互作用的F-質(zhì)粒的松弛體的組分。Whitaker等（2015）報(bào)道了AAD在細(xì)菌結(jié)合中的兩個(gè)重要作用：（i）激活分泌通道；（ii）特異性識(shí)別其同源松弛體和輔助蛋白。然后，缺乏同源T4CP的移動(dòng)遺傳元件必須克服這種特異性才能通過(guò)異源T4SS轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

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相關(guān)內(nèi)容教學(xué)：

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