Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals Cellular Diversity and Intercommunication in the Mouse Heart

摘要：

心臟細胞組（形成心臟的細胞網(wǎng)絡(luò)）的特征對于理解心臟發(fā)育和正常器官功能以及制定精確的治療策略以對抗心臟病至關(guān)重要。最近的研究重塑了對心臟細胞組成的理解，并強調(diào)了非心肌細胞類型的重要功能作用。在這項研究中，作者使用scRNA-seq表征了小鼠非心肌細胞心臟細胞景觀的單細胞轉(zhuǎn)錄譜，揭示了心臟細胞組的多樣性，并促進了分離未研究的心臟細胞群（如壁細胞和膠質(zhì)細胞）的技術(shù)發(fā)展。該研究還揭示了廣泛的細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)，并表明心臟基因表達中普遍存在性別二型性。這項研究為哺乳動物心臟細胞組的結(jié)構(gòu)和功能提供了見解，并為促進心臟細胞生物學(xué)研究提供了重要資源。

為了獲得非肌細胞心臟細胞組的高分辨率圖譜，從雌性和雄性小鼠的心室中制備了活的、代謝活性的、有核的非肌細胞的單細胞懸浮液，用于scRNA-seq分析。為了盡量減少由于酶消化和細胞分選而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄譜的任何潛在變化，選擇了一種解離培養(yǎng)時間相對較短的方案，并在所有后續(xù)步驟中保持細胞懸浮液在冰上（實驗程序）。為了避免內(nèi)皮細胞的過度采樣，將內(nèi)皮細胞的比例降低到占非肌細胞總數(shù)的10%（圖1A）使用10x Chromium平臺獲得了單個細胞的轉(zhuǎn)錄譜，并分析了10519個通過質(zhì)量控制和篩選的細胞，其中每個細胞平均測量了1897個基因。

為了基于共享和獨特的基因表達模式識別不同的細胞群體，使用Seurat軟件進行了降維和無監(jiān)督細胞聚類。鑒定了12個表達主要細胞類型已知標記物的不同細胞簇（圖1B和1C；包括內(nèi)皮細胞（Cdh5，Pecam1），成纖維細胞（2簇；Cola1，Pdgfra，Tcf21），粒細胞（Ccr1，Csf3r，S100a9），淋巴細胞（3簇；Ms4a1、Cd3e、Klrb1c、Ncr1），周細胞（P2ry14、Pdgfrb），巨噬細胞（Adgre1、Fcgr1），樹突狀細胞（DC）樣細胞（Cd209a），雪旺細胞（Plp1、Cnp），平滑肌細胞（SMC；Acta2，Tagln）。定義細胞群的原型標志物（圖1C）包括Col1a1（成纖維細胞）、Ms4a1（B淋巴細胞）、Plp1（雪旺細胞）和Acta2（SMC）。還發(fā)現(xiàn)了其他基因并特別標記了每個主要細胞群（圖1D）。每個主要聚類中表達受限的基因的GO富集分析支持細胞群的預(yù)測身份。例如，成纖維細胞的特異性由與細胞外基質(zhì)相關(guān)的術(shù)語驅(qū)動；白細胞與免疫調(diào)節(jié)術(shù)語相關(guān)；髂內(nèi)細胞和SMC與血管發(fā)育和穩(wěn)態(tài)相關(guān)；雪旺細胞與神經(jīng)調(diào)節(jié)因子有關(guān)。

FIG 1

為了揭示主要細胞類型的異質(zhì)性，對這些群體進行了亞分群（圖2A；圖S1B和S1C）。使用了類似的無監(jiān)督方法，如所述并分析單個類型或多個相關(guān)類型的細胞（例如髓系或淋巴系白細胞）以發(fā)現(xiàn)細胞亞型。對于一些細胞群，如內(nèi)皮細胞、雪旺細胞和SMC，亞聚類沒有識別出轉(zhuǎn)錄上不同的亞群（圖2B），這表明這些細胞群在成熟心臟中相對均勻。相比之下，在其他細胞群體中出現(xiàn)了多水平的亞群異質(zhì)性，其中亞群清晰而明顯地分離了可識別的群體。例如，淋巴細胞群的亞群顯示，第2組先天性淋巴細胞群（ILC2s；Artis和Spits）表達Gata3、Areg和Rora等基因，這些基因以前與T淋巴細胞聚集在一起（圖1B、2A和2B）。此外，僅T淋巴細胞的進一步亞群產(chǎn)生了2個對應(yīng)于CD4+和CD8+T細胞的群（圖2A）。在一些主要的集群中，分化亞群的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性反映了連續(xù)梯度，而不是具有明確基因表達邊界的均質(zhì)細胞的離散組。例如，將所有髓系群體一起進行亞聚類，確定了在整體水平上檢測到的粒細胞群體（圖1B和1C），但巨噬細胞和DC樣亞型不太清楚地分離，并通過轉(zhuǎn)錄梯度連接（圖2A–2C；圖S2）。與基于標記物（如Cx3cr1、H2-Aa/Ab（主要組織相容性復(fù)合體[MHC]II類）、Ccr2、Mrc1和Adgre1）的心臟組織巨噬細胞的典型亞型相比，這呈現(xiàn)了更為細微的巨噬細胞轉(zhuǎn)錄景觀圖。根據(jù)幾個基因組合表達的細微差異，至少可以將巨噬細胞分為五種亞型（圖2A–2C），在某些情況下，在進一步的亞聚類后可以發(fā)現(xiàn)額外的髓系亞群。

在巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了一個細胞亞群，表現(xiàn)出巨噬細胞和成纖維細胞的雜交分子特征，類似于假定的纖維細胞群。這些細胞表達對應(yīng)于成纖維細胞（Col1a1、Pdgfra和Tcf21）和巨噬細胞/白細胞（Fcgr1、Cd14和Ptprc）的中等水平的典型基因（圖2D）。通過檢測PDGFRaGFP/+小鼠心臟中的GFP+白細胞（圖2E），并使用ImageStream細胞術(shù)捕獲攜帶巨噬細胞表面標志物的GFP+單細胞圖像（圖2F），確認了假定纖維細胞的存在。還檢測到在其他幾個主要細胞群中表現(xiàn)出成纖維細胞樣基因特征的小細胞亞群（圖2G），這些亞群似乎是真實的。例如，觀察到Icam2+內(nèi)皮細胞顯示成纖維細胞樣基因表達，用表達Icam2的GFP+單細胞的細胞計數(shù)圖像證實了這一點（圖S3E）。雜交間充質(zhì)表型的表達可能是廣泛細胞類型的固有特征。

在本分析中確定的主要心臟細胞群中，已知心臟細胞群的顯著缺失包括以Tbx18標記的心外膜細胞，其表達分散在成纖維細胞和壁細胞簇內(nèi)的細胞中。標記推定心臟祖細胞的Isl1轉(zhuǎn)錄物存在于4個細胞中，但這些轉(zhuǎn)錄物分散在不同的心臟細胞群中，并沒有形成明顯的簇。表達Prox1和Pdpn的淋巴內(nèi)皮細胞也不存在于人工減少的內(nèi)皮細胞群中，但這些細胞通常只包括占非肌細胞總數(shù)的3%。也沒有檢測到離散的單核細胞群，這些單核細胞以低頻率存在，很可能分散在巨噬細胞簇中?？偟膩碚f，這些細胞群的缺失可能是因為它們的豐度相對較低，并且缺乏高度獨特的轉(zhuǎn)錄特征。

FIG 2

Cspg4和Mcam在壁細胞和雪旺細胞中表達，Pdgfrb在壁細胞及成纖維細胞中表達（圖3A）。ITGA7染色后對常駐間充質(zhì)細胞（RMC；圖S3A）的檢查使壁細胞能夠使用mEF-SK4 作為次要標記物與成纖維細胞區(qū)分開來。該方法鑒定了3個群體：R1（mEF-SK4hiITGA7？），R2（mEF-SK4int/loITGA7+）和R3（mEF-SK4loITGA7？）（圖3C）。對分別在成纖維細胞和壁細胞中標記表達的PDGFRaGFP和CSPG4-GFP小鼠的分析（圖3B–D）表明，PDGFRaGFP/+小鼠心臟中幾乎所有的GFP+RMC都在R1內(nèi)，而CSPG4-GFP小鼠心臟中的幾乎所有GFP+rmC都在R2內(nèi)（圖3D）。相反，對R1–3中GFP+細胞的分析表明，在PDGFRaGFP小鼠心臟中，幾乎所有R1細胞都是GFP+，而在CSPG4-GFP小鼠中，大多數(shù)R2細胞都是GFP+（圖3C）。因此，可以使用mEF-SK4和ITGA7標記物高精度地鑒定和分離心臟成纖維細胞（此處定義為PDGFRa+細胞），其中ITGA7將壁細胞與mEF-SK4低/點成纖維細胞區(qū)分開來。與ITGA7相似，發(fā)現(xiàn)MCAM將壁細胞與成纖維細胞分離，但也標記了雪旺細胞。此外，驗證了ENTPD1, CD59a分別識別SMC和雪旺細胞（圖S3C和S3D）。通過結(jié)合這些標記物，能夠識別和分離SMC、周細胞和雪旺細胞（圖3E和3F）。

FIG 3

在心臟非肌細胞中檢測到同源受體的廣播配體（圖4A）確定成纖維細胞是與多種細胞類型緊密連接的最營養(yǎng)的細胞群（圖4B）。其中包括支持特定心臟細胞群存活的信號電路（圖4C）。例如，成纖維細胞和周細胞分別表達Csf1和Il34（圖4D），它們通過CSF1R發(fā)出信號，是巨噬細胞生長和存活的重要因素。成纖維細胞還表達生長因子Ngf、Vegfa、Igf1、a n d Fgf2（圖4C），它們支持自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和壁細胞的神經(jīng)元。

為了檢測心臟細胞在心臟細胞組內(nèi)支持細胞類型的能力，培養(yǎng)了混合的心臟細胞，并在體外觀察了不同細胞群的生長。LysM-Cre:RosaZsGreen/+小鼠的非肌細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生了大量由ZsGreen熒光蛋白標記的巨噬細胞（圖4E和4F）以及內(nèi)皮細胞（圖4G）。然而，當用CSF1R阻斷抗體、合成CSF1R抑制劑GW2580處理培養(yǎng)物時，或當在沒有非巨噬細胞的正常生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，巨噬細胞無法生長。盡管這些結(jié)果表明成纖維細胞支持心臟巨噬細胞和內(nèi)皮細胞生長，但非成纖維細胞來源的必需生長因子表明了建立心臟生態(tài)位和支持常駐細胞群的細胞網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。分析還表明，不同的細胞群支持心臟的神經(jīng)支配。壁細胞表達Ngf和Ntf3，這兩種都是軸突發(fā)育的重要因素（圖4C）。心臟周細胞Ngf和Ntf3的表達突顯了它們在心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的潛在重要作用。此外，心臟雪旺細胞（外周神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘生成細胞）是一個離散的心臟細胞群。因此，多種心臟細胞類型有助于支持自主神經(jīng)的發(fā)育、維持和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

FIG 4

為了調(diào)查心臟非肌細胞基因表達中的性別二型性，根據(jù)女性（Xist）和男性特異性基因的表達分離了女性和男性細胞（6個Y染色體基因：Ddx3y、Eif2s3y、Erdr1、Gm29650、Kdm5d和Uty；圖5A）。在整體水平上觀察到雌性和雄性細胞的高度相似的聚類模式，但在單個細胞類型中，發(fā)現(xiàn)了許多基因在表達中表現(xiàn)出性別二型性（圖5A）。在女性細胞中上調(diào)的396個基因和男性中上調(diào)的430個基因中，絕大多數(shù)的差異表達低于2倍（圖5B），女性和男性的中位差異為1.17倍。由于基于每種性別的2個生物復(fù)制的比較，分析能力不足，但這些發(fā)現(xiàn)提供了一個機會來表征轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中廣泛的性別依賴性變化，并識別候選的性別二型基因?；虮磉_中的性二形性的具體機制可能多種多樣，包括細胞亞型組成的細微變化以及對激素提示或反式性染色體因子的調(diào)節(jié)反應(yīng)。對每個細胞群體中最高度的性二型基因的分析提供了證據(jù)，證明基因表達中性二型的程度和方向依賴于細胞類型（圖5C；表S5）。此外，鑒定了27個基因，這些基因在細胞類型之間表現(xiàn)出不一致的性二型表達模式（圖5D），揭示了生物性別對心臟基因表達的二分法效應(yīng)。在男性巨噬細胞中，發(fā)現(xiàn)男性上調(diào)基因往往在對外來抗原的反應(yīng)中發(fā)揮作用，GO顯著富集，包括通過MHC II類分子的抗原處理和呈遞，以及更廣泛的免疫反應(yīng)（調(diào)整后p<0.001）。相反，巨噬細胞中的雌性上調(diào)基因在涉及應(yīng)激反應(yīng)和電子傳輸鏈的過程中富集。心臟組織巨噬細胞轉(zhuǎn)錄譜中的性二形性，如男性上調(diào)Irf8，這與慢性炎癥有關(guān)。相反，女性巨噬細胞中最上調(diào)的基因和兩性巨噬細胞中最具性二態(tài)性的基因（圖5C）是Tsc22d3（也稱為Gilz），這是一種與抗炎功能有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，也是糖皮質(zhì)激素有效抗炎作用的下游驅(qū)動因素。Tsc22d3過表達會抑制炎癥并減少心肌細胞死亡。然而，巨噬細胞Tsc22d3的表達不太可能單獨賦予女性心臟抗炎表型，女性心臟也具有與抗炎機制有關(guān)的其他基因的表達升高，如Cebpb（圖5C）。

FIG 5

這項研究建立在先前對心臟細胞多樣性的探索基礎(chǔ)上，并為心臟細胞組的結(jié)構(gòu)和功能提供了獨特見解，表征了小鼠心臟內(nèi)主要非心肌細胞群的單細胞轉(zhuǎn)錄譜。觀察到密集的配體受體網(wǎng)絡(luò)促進了不同細胞類型之間的廣泛溝通，并記錄了生物性別對控制器官功能的轉(zhuǎn)錄程序的貢獻。

使用scRNA-seq數(shù)據(jù)集開發(fā)了使用流式細胞術(shù)更精確地識別心臟壁細胞、成纖維細胞和雪旺細胞的策略。

總結(jié)的點：

1.識別了多種非心肌細胞的類型，并在淋巴細胞，巨噬細胞中分出了一些細胞亞群；在巨噬細胞中，有一種細胞亞群既有巨噬細胞的特征，也有成纖維細胞的特征。

2.使用mEF-SK4和ITGA7標記物高精度地鑒定和分離心臟成纖維細胞（此處定義為PDGFRa+細胞），其中ITGA7將壁細胞與mEF-SK4低/點成纖維細胞區(qū)分開來。

3.細胞通訊分析發(fā)現(xiàn)成纖維細胞是與多種細胞類型緊密連接的最營養(yǎng)的細胞群，其中包括支持特定心臟細胞群存活的信號電路。成纖維細胞還表達生長因子Ngf、Vegfa、Igf1、a n d Fgf2，它們支持自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和壁細胞的神經(jīng)元。