2023.4.14

本文記錄從Genome-wide analysis of cytochrome P450 genes in Citrus clementina and characterization of a CYP gene encoding flavonoid 3′-hydroxylase文獻中總結(jié)的基因家族分析步驟。這篇文章包含生物信息學分析和分子生物學試驗，是典型的“干濕結(jié)合”，其文章結(jié)構(gòu)和思路值得借鑒。本文主要記錄生物信息學分析部分，包括柑橘中CYP基因的鑒定、蛋白的物理化學功能預(yù)測、預(yù)測亞細胞定位、進化樹的構(gòu)建、保守motif分析、基因結(jié)構(gòu)分析、共線性和基因復制分析、啟動子分析。

柑橘中CYP基因的鑒定

準備工作：從Phytozome v13 https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/ Cclementina_v1_0下載最新柑橘基因組。

1.從PFAM下載CYPs保守結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的隱馬爾可夫模型（HMM），使用HMMER（evalue=0.1）對柑橘蛋白數(shù)據(jù)庫進行HMM搜索。
2.下載擬南芥中CYPs基因的氨基酸序列，作為query序列，在柑橘蛋白數(shù)據(jù)庫進行本地Blastp搜索（e-value=1e-5）。
3.將以上兩步得到的序列合并，去除重復。
4.通過NCBI Conserved Domain Database toolhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi驗證序列保守結(jié)構(gòu)域，得到柑橘中所有的CYPs基因。

蛋白的物理化學功能預(yù)測

5.利用ExPASy https://web.expasy.org/protparam/中的ProtParam工具計算CYPs的各種物理和化學參數(shù)，包括氨基酸數(shù)量、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)等等。

預(yù)測亞細胞定位

6.利用BUSCAhttp://busca.biocomp.unibo.it/預(yù)測CYPs的亞細胞定位。

進化樹的構(gòu)建

7.使用MUSCLE或ClustalW進行序列比對（根據(jù)需要選擇比對方式）（ClustalW的基本原理是首先做序列的兩兩比對，根據(jù)該兩兩比對計算兩兩距離矩陣，是一種經(jīng)典的比對方法，使用范圍也比較廣泛。Muscle的功能僅限于多序列比對，它的最大優(yōu)勢是速度，比ClustalW的速度快幾個數(shù)量級，而且序列數(shù)越多速度的差別越大）。
8.使用trimAl自動去除排列不齊的區(qū)域（這里也可以使用TBTools中的Trimmer快速修剪工具Quick Run TrimAL工具）。
9.使用MEGA或IQ-TREE（最大似然法/鄰接法）構(gòu)建進化樹，使用ITOLshttps://itol.embl.de/美化。

保守motif分析

10.使用MEMEhttps:// meme-suite.org/meme/tools/meme識別CYPs保守motif基序（參數(shù)：number of motifs to find = 15; min motif width = 6; and max motif width = 50），，利用TBTools可視化。

基因結(jié)構(gòu)分析

11.從柑橘基因組注釋文件（gff3）中獲得CYPs基因結(jié)構(gòu)，包括外顯子、內(nèi)含子、CDS和UTR，利用TBTools可視化。

共線性和基因復制事件分析

12.使用MCScanX分析柑橘CYPs基因之間的共線性關(guān)系和基因復制事件；使用shinyCircos可視化CYPs基因?qū)Φ耐絽^(qū)和重復事件。
13.使用TBTools生成基因密度分布，可用shinyCircos可視化。
14.使用TBTools中的Simple Ka/Ks Calculator實現(xiàn)Non-synonymous（Ka）/synonymous（Ks）計算。
15.使用TBTools將柑橘CYPs的基因位點定位到基因組的scaffolds。

啟動子分析

16.每條基因ATG前2000bp作為啟動子區(qū)域，使用PlantCAREhttps://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/預(yù)測順式作用元件，使用TBTools可視化。