帕金森病（parkinson’s disease, PD）是繼阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）之后第二常見的一種神經(jīng)退行性疾病，多見于中老年人，患者主要表現(xiàn)為震顫、行動遲緩、肌強(qiáng)直等運(yùn)動癥狀和一系列非運(yùn)動癥狀。其目前的治療方案只能緩解患者的癥狀，并不能阻止PD的進(jìn)展，而PD是一種進(jìn)行性惡化的疾病，因此找到能阻止PD進(jìn)展的治療方案十分重要。

2018年11月2日美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病和干細(xì)胞研究中心Valina L. Dawson和Ted M. Dawson團(tuán)隊在Science雜志發(fā)表了題為Poly(ADP-ribose) drives pathologic α-synuclein neurodegeneration in Parkinson’s disease的研究論文，發(fā)現(xiàn)Poly(ADP-ribose)可以增強(qiáng)α-synuclein毒性，促進(jìn)α-synuclein聚集，并參與病理性α-synuclein介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，促進(jìn)PD進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)或許能為阻止PD的進(jìn)展提供治療靶點[1]。Science雜志同時對此研究結(jié)果發(fā)表了評論文章[2]。

有沒有覺得哪個分子很眼熟？對了，Poly(ADP-ribose) 就是PAR，上一篇文章也有提到哦。

現(xiàn)在咱們一起學(xué)習(xí)下這篇文章吧。

背景介紹

帕金森病和α-突觸核蛋白

帕金森病是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，患者主要表現(xiàn)為靜止性震顫、行動遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)障礙四大運(yùn)動癥狀，有的還伴有焦慮、抑郁、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能障礙、認(rèn)知障礙等非運(yùn)動癥狀。

帕金森病主要的病理改變是中腦黑質(zhì)部多巴胺（dopamine, DA）能神經(jīng)元減少，殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體（Lewy body）。纖維樣的α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-syn）是路易小體的主要成分。

α-syn是在大腦中廣泛表達(dá)的一種突觸前蛋白，生理狀態(tài)下呈可溶的蛋白單體形式，當(dāng)其聚集成不溶的纖維樣寡聚體，則具有致病性，可引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡。病理性的α-syn可以像朊病毒一樣在細(xì)胞間傳播，促進(jìn)PD進(jìn)展。

然而是什么引起α-syn的病理性聚集呢？病理性聚集的α-syn又是如何引起細(xì)胞死亡的？這些都還不清楚。

PAR與PARP1

Poly(ADP-ribose) （PAR）是Poly(ADP-ribose) polymerase-1（PARP-1）以NAD+為底物合成的產(chǎn)物。細(xì)胞核PARP-1和PAR的主要功能是發(fā)現(xiàn)各種原因引起的DNA損傷，并啟動相應(yīng)的DNA修復(fù)機(jī)制。

PARP-1依賴性細(xì)胞死亡

PARP-1依賴性細(xì)胞死亡（Parthanatos）是一種由于PARP-1激活引起的程序性細(xì)胞壞死形式，Parthanatos是根據(jù)“par”（PARP-1的酶學(xué)產(chǎn)物）+ “thanatos”（希臘語的死亡之神）而命名。

Parthanatos這種細(xì)胞死亡形式廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病等疾病中。

因為Parthanatos中PARP-1和PAR可引起細(xì)胞死亡，故作者擬探究PARP-1和PAR是否參與PD中病理性α-syn引起的DA神經(jīng)元丟失。

方法與結(jié)果

1?α-syn?PFF的神經(jīng)毒性依賴于PARP-1

α-syn預(yù)制纖維（a-syn preformed fibrils, α-syn PFF）是一種體外重組的α-syn，能夠像體內(nèi)的α-syn一樣聚集成纖維，并能像朊病毒一樣在神經(jīng)元細(xì)胞間傳播，當(dāng)其被注射進(jìn)小鼠的腦內(nèi)，其S129位點可發(fā)生磷酸化，形成p-α-syn（病理性α-syn的一個標(biāo)志），因此是研究α-syn的一個良好模型。

為了探究α-syn PFF能否激活PARP-1，作者用α-syn PFF處理鼠的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，WB檢測PAR的變化，發(fā)現(xiàn)第3-7d PAR的表達(dá)逐漸增加直至最高峰，并維持增加狀態(tài)直到第14d。

此圖為原文Fig. 1A。

PI染色發(fā)現(xiàn)PAR的增加伴隨著細(xì)胞死亡的增加。

用三種PARP抑制劑（ABT-888, AG-014699, BMN 673）處理細(xì)胞，則發(fā)現(xiàn)可以阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞PARP激活和細(xì)胞死亡。

此圖為原文Fig. 1B-D。B圖為Hoechst染色和PI染色觀察細(xì)胞死亡。

α-syn PFF處理細(xì)胞能夠促進(jìn)α-syn進(jìn)行 S129位點的磷酸化形成p-α-syn，并促進(jìn)水溶性α-syn形成不溶性α-syn，兩者都是病理性α-syn的特征。而PARP抑制劑能夠明顯阻止這些效應(yīng)。

此圖為原文Fig. S1F-I。

敲低或敲除PARP-1亦能明顯阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的PARP激活和細(xì)胞凋亡。

此圖為原文Fig. 1E-H。

此圖為原文Fig. S2A-B。

敲除PARP-1能夠阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的α-syn的磷酸化及不溶性α-syn的形成。

此圖為原文Fig. S2C-F。

用廣譜的caspase抑制劑Z-VAD能部分減輕α-syn PFF的毒性，而壞死性凋亡抑制劑Nec-1和自噬抑制劑3-MA無法減輕α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，PARP抑制劑ABT-888則能夠阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，說明α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要依賴于PARP-1，即parthanatos，而不是通過激活細(xì)胞凋亡、壞死或自噬。

此圖為原文Fig. S2G-I。

上述實驗結(jié)果顯示敲除PARP-1或藥物抑制PARP-1能夠減少p-α-syn的形成，這種減少會不會是因為細(xì)胞內(nèi)吞的α-syn PFF減少呢？

作者富集細(xì)胞內(nèi)吞體，檢測PARP-1敲除和藥物抑制條件下內(nèi)吞體內(nèi)biotin標(biāo)記的α-syn PFF含量，發(fā)現(xiàn)均與對照組無明顯差異，說明PARP-1不影響細(xì)胞對α-syn PFF的攝入。

此圖為原文Fig. S3A-D。

背景介紹中提到α-syn PFF能像朊病毒般在細(xì)胞間傳播，促進(jìn)PD進(jìn)展，那它的這種細(xì)胞間傳播的特性是否也依賴于PARP-1呢？

作者進(jìn)行了微流控室實驗，首先通過微流體裝置將α-syn PFF加入到chamber 1 (C1)，第14d再檢測chamber 2 (C2) 和chamber 3 (C3)中是否出現(xiàn)α-syn，即α-syn PFF是否有傳播功能。

結(jié)果顯示W(wǎng)T神經(jīng)元組第14d可在C2和C3中可檢測到p-α-syn， 而PARP-1 KO組基本檢測不到，說明α-syn PFF的傳播功能也依賴于PARP-1。

此圖為原文Fig. S3E-G。F圖為E圖的高分辨率圖像。

2?α-syn PFF通過NO誘導(dǎo)的DNA損傷激活PARP-1

第一部分已經(jīng)證明α-syn PFF能夠激活PARP-1，并通過PARP-1發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用，那么α-syn PFF是如何激活PARP-1的呢？

作者發(fā)現(xiàn)用α-syn PFF處理神經(jīng)元細(xì)胞或?qū)⑵渲苯幼⑸涞叫∈竽X內(nèi)，可引起細(xì)胞的NO水平增加及DNA損傷增加。

用NO合成酶抑制劑L-NAME處理神經(jīng)元細(xì)胞或小鼠大腦，則可以抑制α-syn PFF誘導(dǎo)的NO合成、DNA損傷及PARP-1激活。

此圖為原文Fig. 2。SNpc為小鼠的黑質(zhì)致密帶，γH2AX為DNA損傷的標(biāo)志物。

此外NO合成酶抑制劑還可以抑制α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

此圖為原文Fig. S4E-G。

以上說明α-syn PFF通過激活NO合成酶，引起DNA損傷，激活PARP-1，通過parthanatos引起細(xì)胞死亡。

3?α-syn?PFF通過PAR介導(dǎo)DA神經(jīng)元丟失

前面已經(jīng)證明α-syn PFF通過parthanatos引起細(xì)胞死亡，那么這一通路會不會跟PD中DA神經(jīng)元的丟失有關(guān)？

向小鼠一側(cè)的紋狀體內(nèi)注射α-syn PFF可激活PARP-1，增加PAR水平，而敲除PARP-1或用PARP-1抑制劑處理后，可阻止α-syn PFF誘導(dǎo)的PAR水平增加，減輕α-syn PFF的神經(jīng)毒性。

同時，注射α-syn PFF 6個月后，WT小鼠注射側(cè)DA神經(jīng)元減少約50%，而PARP-1敲除組和PARP-1抑制劑處理組小鼠的DA神經(jīng)元無明顯減少。

此圖為原文Fig. 3A-B。B圖為酪氨酸羥化酶染色和Nissl染色顯示單側(cè)紋狀體注射α-syn PFF 6個月后小鼠SNpc的DA神經(jīng)元數(shù)量，對側(cè)（Contralateral）作為對照。C圖為B圖的定量。

酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）是DA合成的關(guān)鍵酶，作者發(fā)現(xiàn)用α-syn PFF處理WT小鼠后，TH和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)子（DA transporter, DAT）水平均明顯降低，而敲除或抑制PARP-1，可阻止該現(xiàn)象。

此圖為原文Fig. S5A-E。

此外，α-syn PFF處理的WT小鼠紋狀體DA和DA代謝產(chǎn)物含量明顯減少，PARP-1 KO組和PARP-1抑制劑處理組無明顯變化。

此圖為原文Fig. 3D。

此圖為原文Fig. S5F-H。DOPAC、3-MT、HVA均為DA的代謝產(chǎn)物。

向WT小鼠大腦注射α-syn PFF可引起小鼠爬桿試驗（pole test）時間延長，握力試驗（grip strength）力量降低，敲除PARP-1或PARP-1抑制劑處理則可緩解α-syn PFF引起的PD運(yùn)動癥狀。

此圖為原文Fig. 3E-F。爬桿試驗是檢測小鼠肢體協(xié)調(diào)能力的一種行為學(xué)實驗，測量小鼠從木桿頂端爬到底端所需的時間，時間越短，則說明肢體協(xié)調(diào)能力越好。

4?PAR促進(jìn)α-syn纖維化

既往研究顯示PAR能夠?qū)е鹿逃袩o序蛋白液體分層，引起其聚集，那么PAR能否促進(jìn)α-syn聚集呢？

在加或不加PAR的條件下，作者觀察α-syn單體孵育一段時間后聚合物的生成情況，發(fā)現(xiàn)不加PAR時，α-syn單體孵育72h才出現(xiàn)不同分子量的α-syn聚合物，而加了PAR，24h即出現(xiàn)不同分子量的α-syn聚合物。

不同孵育溫度或不同濃度的PAR可引起α-syn纖維化效率的不同（原文Fig. S7A-C）。

此圖為原文Fig. 4A。此圖為在加5nM PAR或不加PAR 條件下，α-syn單體在37℃孵育相應(yīng)的時間。

熒光染料硫黃素T（thioflavin T fluorescence, ThT）可用于淀粉樣纖維聚集過程的定性定量監(jiān)測。通過ThT熒光監(jiān)測可見PAR能明顯促進(jìn)α-syn聚集。

透射電鏡觀察到不加PAR時，α-syn單體孵育72h才出現(xiàn)α-syn寡聚體纖維，而加了PAR，12h即可看到α-syn寡聚體的形成。

此圖為原文Fig. 4B-C。

因為PAR是個高度帶負(fù)電的分子，為排除PAR引起的α-syn聚集是由于蛋白間的電荷相互作用，作者研究了同樣帶負(fù)電的PolyA分子對α-syn聚集的影響，發(fā)現(xiàn)其并沒有顯著促進(jìn)α-syn聚集。

Overlay assay顯示PAR與α-syn之間有相互作用，而ADP ribose（ADPr）單體與α-syn之間沒有相互作用，也不影響α-syn的聚集。

此圖為原文Fig. S7D-F。D圖是overlay assay，用于檢測蛋白間的相互作用。

PARP-1能夠促使蛋白發(fā)生ADP核糖基化，那么它會使α-syn發(fā)生核糖基化嗎？

體外核糖基化實驗（IVRA）顯示不會。

Overlay assay和Co-IP均顯示α-syn與PAR之間存在相互作用，作者運(yùn)用deletion analysis和Co-IP確認(rèn)α-syn通過其氨基端與PAR作用。

此圖為原文Fig. S8，顯示α-syn通過其氨基酸與PAR相互作用。

為了探究內(nèi)源性的PAR生成是否能促進(jìn)α-syn聚集，作者用N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)處理過表達(dá)α-syn的原代鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NMDA可激活PARP，引起α-syn聚集，而敲除PARP-1或用PARP-1抑制劑處理后，α-syn不再聚集。

此圖為原文Fig. 4D-E。

在過表達(dá)α-syn的PARP-1 WT型和PARP-1 KO型細(xì)胞中外源給予PAR，均可rescue α-syn的聚集。

在過表達(dá)WT型α-syn和α-syn A53T的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中，給予PARP激活劑MNNG可促進(jìn)α-syn聚集，敲除PARP-1或給予PARP-1抑制劑后，α-syn聚集減少，外源補(bǔ)充PAR則可同樣rescue PARP-1敲除或抑制引起的α-syn聚集減少。

此圖為原文Fig. S9，說明PAR促進(jìn)α-syn纖維化。

5?PAR增強(qiáng)α-syn?PFF的體外毒性

前面證明了PAR與α-syn PFF結(jié)合，那么這種結(jié)合會改變α-syn PFF的生物物理屬性嗎？

作者用蛋白酶K（proteinase K）消化α-syn PFF處理的和PAR-α-syn PFF處理的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PAR-α-syn PFF處理的細(xì)胞更能抵抗PK的消化，提示PAR-α-syn PFF可能折疊的更緊密。

此圖為原文Fig. 4F。

第一部分已經(jīng)證明了α-syn具有神經(jīng)毒性，作者大致重復(fù)第一部分的實驗，如PAR促進(jìn)細(xì)胞死亡（原文Fig. S10）、促進(jìn)p-α-syn生成、促進(jìn)不溶性α-syn生成、促進(jìn)α-syn的內(nèi)吞和傳播（原文Fig. S11），證明PAR能明顯增強(qiáng)α-syn的體外毒性。

此圖為原文Fig. 4G-H，顯示PAR-PFF促進(jìn)p-α-syn生成和不溶性α-syn生成。

6?PAR增強(qiáng)α-syn?PFF的體內(nèi)毒性

為了探究PAR對α-syn PFF體內(nèi)毒性的影響，作者將α-syn PFF或PAR–α-syn PFF注射到小鼠一側(cè)的紋狀體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)注射PAR–α-syn PFF組更早出現(xiàn)DA神經(jīng)元的丟失，更早形成p-α-syn，且p-α-syn的水平明顯高于注射α-syn PFF組。

此外，與α-syn PFF相比，PAR–α-syn PFF明顯促進(jìn)DA及其代謝產(chǎn)物的丟失（原文Fig. S13），TH和DAT水平下降（原文Fig. S14），小鼠爬桿實驗和握力實驗表現(xiàn)變得更差。

圖為原文Fig. 5A-G。A圖為注射側(cè)TH染色和Nissl染色，B圖為TH染色定量。C-D圖顯示PAR促進(jìn)p-α-syn形成。E圖顯示注射側(cè)紋狀體DA的含量。

7?PD患者腦脊液PAR水平增加

作者檢測兩個獨立隊列的PD患者和對照者的腦脊液（CSF）的PAR水平，均發(fā)現(xiàn)PD患者CSF的PAR水平明顯增加，且PAR的水平與疾病持續(xù)時間和Hoehn & Yahr分期呈正相關(guān)。

此圖為原文Fig. 6。A-D圖顯示的是隊列1（80名PD vs 31名Control）的數(shù)據(jù)，E-H圖顯示的是隊列2（21名PD vs 33名Control）的數(shù)據(jù)。Hoehn & Yahr分期是一個用來評價PD病情嚴(yán)重程度的分級表，分為0-5期，數(shù)字越大，代表病情越嚴(yán)重。

此外，作者發(fā)現(xiàn)PD患者黒質(zhì)（substantia nigra, SN）的PAR水平也明顯增加，這一點與既往的研究結(jié)果一致。

此圖為原文Fig. S15。A圖為ELISA檢測PAR的梯度稀釋曲線，顯示該方法能夠檢測PAR的濃度范圍為3pM~50nM。

結(jié)論

病理性α-syn通過激活NO合成酶，誘導(dǎo)DNA損傷，激活PARP-1，產(chǎn)生的PAR促進(jìn)病理性α-syn的生成，通過parthanatos引起細(xì)胞死亡。敲除或降低PARP-1可抑制病理性α-syn的毒性。PAR可在體內(nèi)和體外增強(qiáng)病理性α-syn的毒性，形成前饋循環(huán)。PD患者的腦脊液和黒質(zhì)的PAR含量明顯增加。以上提示PARP-1的激活參與PD的進(jìn)展，因此抑制PARP-1的激活有望阻止PD中DA神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失。

此圖為全文的故事圖解。

學(xué)霸總結(jié)

本文套路如下圖所示。

希望本文能給你啟發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[1]?Kam TI, et al. Poly(ADP-ribose) drives pathologic alpha-synuclein neurodegeneration in Parkinson's disease [J]. Science (New York, NY), 2018, 362(6414).

[2]?Brundin P, et al. Cancer enzyme affects Parkinson's disease [J]. Science (New York, NY), 2018, 362(6414): 521-522.