Mol Cell | 緊湊型CRISPR技術(shù)更易于傳遞至細(xì)胞，治療潛力巨大

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由斯坦福大學(xué)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)領(lǐng)導(dǎo)的科學(xué)家開發(fā)了一種緊湊、高效的CRISPR-Cas系統(tǒng)，稱為CasMINI，其大小約為現(xiàn)有CRISPR-Cas系統(tǒng)的一半，可廣泛用于基因治療應(yīng)用和細(xì)胞工程。研究人員在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，CasMINI可以像其較大的同類產(chǎn)品一樣，刪除、激活和編輯目標(biāo)基因序列。但CasMINI相對(duì)較小的尺寸意味著它更容易進(jìn)入人體細(xì)胞和人體，使其成為治療多種疾病的潛在工具，包括眼病、器官退化和遺傳疾病。

通常使用的CRISPR系統(tǒng)，例如基于Cas9和Cas12a CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）的系統(tǒng)，由大約1000到1500個(gè)氨基酸組成，而新的CasMINI系統(tǒng)只有529個(gè)氨基酸。

“這是CRISPR基因組工程應(yīng)用向前邁出的關(guān)鍵一步?！辟Y深研究作者、斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院化學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)助理教授、斯坦福大學(xué)ChEM-H研究所學(xué)者Stanley Qi博士說，“據(jù)我們所知，這項(xiàng)工作展示了迄今為止最小的CRISPR，作為一種基因組編輯技術(shù)。如果人們有時(shí)認(rèn)為Cas9是一把分子剪刀，那么我們?cè)谶@里創(chuàng)造了一把包含多種功能的瑞士刀。它不是一個(gè)大的，而是一個(gè)小型的，便于攜帶和使用。”

這項(xiàng)研究發(fā)表在《Molecular Cell》上的一篇題為“Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing”的論文中。

作者寫道，用于人類細(xì)胞的CRISPR-Cas系統(tǒng)的開發(fā)已經(jīng)“徹底改變了基因組工程”。但是，盡管這些系統(tǒng)為各種遺傳疾病的基因療法的發(fā)展提供了機(jī)會(huì)，但它們的大尺寸往往限制了向細(xì)胞的傳遞，從而限制了它們潛在的臨床應(yīng)用。例如，廣泛應(yīng)用于體內(nèi)遞送的腺相關(guān)病毒（AAV）載體的有效載荷包裝容量限制小于4.7kb，而許多Cas融合蛋白超出了這個(gè)范圍。研究人員表示：“CRISPR-Cas?效應(yīng)子及其融合蛋白的大尺寸對(duì)有效的細(xì)胞工程和體內(nèi)遞送提出了挑戰(zhàn)。我們迫切需要設(shè)計(jì)高效、緊湊的Cas系統(tǒng)，以促進(jìn)下一代基因組工程應(yīng)用?！?/p>

一種可能的解決方案是Cas12f，也稱為Cas14，它的大小不到當(dāng)前使用的CRISPR系統(tǒng)（如Cas9或Cas12a）的一半。但直到現(xiàn)在，還不清楚這種緊湊型蛋白質(zhì)是否可以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞?！敖陙硪呀?jīng)鑒定出數(shù)千種CRISPR，它們被稱為細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)。然而，超過99.9%的已發(fā)現(xiàn)CRISPR無法在人類細(xì)胞中發(fā)揮作用，這限制了它們作為基因組編輯技術(shù)的使用?！毖芯咳藛T解釋說。

在他們新報(bào)告的工作中，Qi及其同事將?RNA?和蛋白質(zhì)工程應(yīng)用于Cas12f系統(tǒng)，以生成一個(gè)高效的哺乳動(dòng)物基因組工程微型Cas系統(tǒng)。通過優(yōu)化單向?qū)NA設(shè)計(jì)并進(jìn)行多輪迭代蛋白質(zhì)工程和篩選，研究人員生成了一類名為CasMINI的Cas12f變體。

研究人員決定從CRISPR蛋白Cas12f開始，因?yàn)樗话蠹s400到700個(gè)氨基酸?？茖W(xué)家們指出：“工程化CasMINI分子的大小為529個(gè)氨基酸，分別比常用的SpCas9（1368個(gè)氨基酸）和LbCas12a（1228個(gè)氨基酸）小62%和57%?！比欢c其他CRISPR蛋白一樣，Cas12f天然起源于古細(xì)菌——單細(xì)胞生物——這意味著它不太適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更不用說人類細(xì)胞或身體了。已知只有少數(shù)CRISPR蛋白無需修飾即可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用。不幸的是，CAS12f不是其中之一。這對(duì)生物工程師們來說是一個(gè)誘人的挑戰(zhàn)?！拔覀兿耄冒?，數(shù)百萬年的進(jìn)化并沒有能夠?qū)⑦@個(gè)CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成在人體內(nèi)發(fā)揮作用的東西。我們能在一兩年內(nèi)改變這種狀況嗎？”研究人員說，“據(jù)我所知，我們第一次將無效的CRISPR變成了有效的CRISPR。”

Xiaoshu Xu是Qi實(shí)驗(yàn)室的博士后學(xué)者，也是這項(xiàng)新報(bào)告研究的主要作者，她在人體細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)天然Cas12f的活性。Xu和Qi假設(shè)問題在于人類基因組DNA比微生物DNA更復(fù)雜，且更難獲得，這使得Cas12f很難在細(xì)胞中找到目標(biāo)。通過觀察Cas12f系統(tǒng)的計(jì)算預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，她仔細(xì)選擇了蛋白質(zhì)中大約40個(gè)可能繞過這一限制的突變，并建立了一條一次測(cè)試許多蛋白質(zhì)變體的管道。理論上，一種有效的變體可以通過激活其基因組中的綠色熒光蛋白?(GFP)?將人類細(xì)胞變成綠色。

“起初，這個(gè)系統(tǒng)在一年內(nèi)根本不起作用?！毖芯咳藛T說，“但經(jīng)過生物工程的反復(fù)試驗(yàn)，我們看到一些工程蛋白質(zhì)開始像魔法一樣啟動(dòng)。這讓我們真正體會(huì)到合成生物學(xué)和生物工程的威力。”

雖然第一次成功的結(jié)果只是適度的，但團(tuán)隊(duì)受到了鼓舞，因?yàn)榧词故沁m度的結(jié)果也意味著系統(tǒng)有效。經(jīng)過多次迭代，研究人員能夠進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的性能?！拔覀円婚_始只看到兩個(gè)細(xì)胞顯示綠色信號(hào)，現(xiàn)在經(jīng)過改造，在顯微鏡下幾乎每個(gè)細(xì)胞都是綠色的?！毖芯咳藛T說。但通過優(yōu)化單導(dǎo)向RNA設(shè)計(jì)和進(jìn)行多輪迭代蛋白質(zhì)工程和篩選，研究人員生成了一類名為CasMINI的Cas12f變體。

除了他們的蛋白質(zhì)工程工作外，研究人員還設(shè)計(jì)了將Cas蛋白引導(dǎo)至其目標(biāo)DNA的RNA。對(duì)這兩種成分的修飾對(duì)于使CasMINI系統(tǒng)在人類細(xì)胞中發(fā)揮作用至關(guān)重要。令人鼓舞的是，工程化Cas12f蛋白變體與工程化單導(dǎo)向RNA相結(jié)合，顯示出有效的基因調(diào)控和基因編輯活性。“通過優(yōu)化單導(dǎo)向RNA（sgRNA）設(shè)計(jì)并進(jìn)行多輪迭代蛋白質(zhì)工程和篩選，我們產(chǎn)生了一類Cas12f變體（即CasMINI），當(dāng)與轉(zhuǎn)錄激活劑融合時(shí)，可以有效激活報(bào)告基因和內(nèi)源性基因表達(dá)?！弊髡邎?bào)告說。他們測(cè)試了CasMINI在實(shí)驗(yàn)室人類細(xì)胞中刪除和編輯基因的能力，包括與HIV感染、抗腫瘤免疫反應(yīng)和貧血相關(guān)的基因。它對(duì)他們測(cè)試的幾乎所有基因都起作用，對(duì)幾個(gè)基因產(chǎn)生了強(qiáng)烈的反應(yīng)。

測(cè)試表明，CasMINI可以驅(qū)動(dòng)高水平的基因激活，與Cas12a相關(guān)的基因激活水平相當(dāng)，并允許進(jìn)行穩(wěn)健的堿基編輯和基因編輯。此外，該系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)具有高度特異性，并且不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的脫靶效應(yīng)。作者指出：“這種dCasMINI介導(dǎo)的基因激活比野生型dCas12f系統(tǒng)有顯著的改善，具有與dCas12a系統(tǒng)相當(dāng)?shù)募せ钅芰Γ⑶以诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中具有特異性，而沒有可檢測(cè)到的脫靶?！弊髡咧赋?，“CasMINI為廣泛的基因組工程應(yīng)用提供了一個(gè)有用的工具，這些應(yīng)用需要緊湊的Cas融合蛋白來傳遞和發(fā)揮細(xì)胞功能?！?/p>

“在這里，我們通過合理的RNA工程和蛋白質(zhì)工程，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不工作的CRISPR轉(zhuǎn)化為高效工作的CRISPR?！毖芯咳藛T說，“此前，其他人曾努力提高工作CRISPR的性能。但我們的工作是第一次使非工作CRISPR發(fā)揮作用。這凸顯了生物工程在實(shí)現(xiàn)進(jìn)化尚未實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)方面的力量。”

工程化CasMINI分子的大小僅為529個(gè)氨基酸。這種小尺寸使其適用于廣泛的治療應(yīng)用。CasMINI融合蛋白也非常適合AAV包裝?！拔覀兎治隽薈asMINI與廣泛使用的阻遏因子、激活因子和基因編輯域的融合，并觀察到它們都低于AAV包裝限制（<4.7 kb）?！毖芯咳藛T說。此外，CasMINI mRNA可以很容易地包裝到脂質(zhì)納米顆?；蚱渌鸕NA遞送方式中，從而有可能增強(qiáng)其進(jìn)入細(xì)胞的能力。“我們還假設(shè)，與大蛋白有效載荷相比，它的小尺寸和非人類病原體來源使其可能具有較低的免疫原性?！毖芯啃〗M補(bǔ)充道，“我們?cè)O(shè)想在本研究中開發(fā)的這些合成的、緊湊的Cas效應(yīng)器將廣泛用于基因治療和細(xì)胞工程應(yīng)用?！?/p>

需要做更多的工作來進(jìn)一步優(yōu)化CasMINI在堿基編輯和基因編輯方面的效率，并用不同的遞送方式在體內(nèi)測(cè)試系統(tǒng)的性能。研究人員計(jì)劃對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)基因治療應(yīng)用測(cè)試?！拔⑿虲asMINI的可用性實(shí)現(xiàn)了新的應(yīng)用，從體外應(yīng)用，如設(shè)計(jì)更好的腫瘤殺傷淋巴細(xì)胞或重編程干細(xì)胞，到治療眼睛、肌肉或肝臟遺傳疾病的體內(nèi)基因治療?！毖芯咳藛T指出，“在我們的愿望清單上，它將成為一種治療遺傳疾病、治愈癌癥和逆轉(zhuǎn)器官退化的療法?！?/p>

研究人員已經(jīng)開始建立合作，以尋求基因療法。他們還對(duì)如何促進(jìn)RNA技術(shù)的進(jìn)步感興趣，例如用于開發(fā)mRNA COVID-19疫苗的RNA技術(shù)，其中大小也可能是一個(gè)限制因素。

“自CRISPR早期以來，這種設(shè)計(jì)這些系統(tǒng)的能力就一直是該領(lǐng)域所渴望的，我覺得我們?yōu)閷?shí)現(xiàn)這一目標(biāo)盡了自己的一份力量?！毖芯咳藛T說，“而且這種工程方法可以提供如此廣泛的幫助。這就是讓我興奮的地方——為新的可能性打開大門?！?/p>

作者指出，雖然先前的研究已經(jīng)使用蛋白質(zhì)工程技術(shù)來產(chǎn)生增強(qiáng)的Cas12a或Cas12b變體，但新的研究表明，可以從在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒有可檢測(cè)活性的初始系統(tǒng)開始設(shè)計(jì)有效的Cas12f效應(yīng)器?！斑@項(xiàng)工作中使用的RNA和蛋白質(zhì)工程方法可能適用于設(shè)計(jì)更多來自其他細(xì)菌或古細(xì)菌物種的Cas12f/Cas14效應(yīng)子?！彼麄冋f，“這些結(jié)果可能表明Cas12家族中的許多系統(tǒng)可以通過蛋白質(zhì)和引導(dǎo)RNA工程進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更好的效率?！?/p>