???????哈嘍大家好，前面小編和大家分享了ATAC-seq數(shù)據(jù)分析的流程，那么，ATAC-seq建庫是否也可以DIY呢？下面就和大家分享一則ATAC-seq建庫的protocol吧~(關注我們的公眾號并在后臺回復“ATACseq”可獲取更多ATAC-seq實驗protocol及數(shù)據(jù)分析代碼)

材料試劑：

2ml glass tissue grinder and pestle (Kimble chase, 885301-0002, 885300-0002)

40 μm cell strainer (Fisher, 352340)

Illumina Tagment DNA buffer (Cat#: 15027866) (TD buffer)

Illumina Nextera Tagment DNA enzyme (Cat#: 15027916) (TDE)

NEBNext High-Fidelty 2xPCR Master Mix (NEB M0514S)

10,000 x SYBR Green I (Invitrogen Cat# -7563)

實驗步驟：

1. 將冷凍的組織（5-10 mg）于干冰及液氮中研磨成粉末狀；

2. 將粉碎的組織重懸于1 ml 1×PBS中，4℃，2000g離心3 min；

3. 去上清，于1 ml LB1中重懸；

4. 4℃搖床孵育10 min；

5. 將樣品轉移至2 ml 玻璃試管中，輕輕震蕩15次，重新轉移至1.5 ml Ep管中；

6. 4℃，2000g離心5 min；

7. 去上清，于1 ml 預冷PBS中重懸；

8. 過40 uM細胞篩網(wǎng)；

9. 取10^5個細胞核（臺盼藍染色計數(shù)）至新的1.5 mL Ep管中，每樣重復3次，并用PBS將體積補齊至50ul；

10. 4℃，500g離心 10min；去上清；

11. 每管樣品加入12.5 uL TD緩沖液，10 uL ddH2O以及2.5 uL TDE，轉移至PCR管中；

12. PCR儀中37℃孵育1 h。

13. 采用Qiagen MiniElute分離轉座酶處理的DNA（此時可于-20℃保存，或進行文庫擴增）

14. 文庫擴增

反應體系：

PCR程序：（為減少PCR過程中的GC及片段長度偏差，第一輪PCR設置5輪擴增）

15. qPCR預測PCR反應最適的循環(huán)數(shù)

反應體系：

qPCR程序：

16. 最適PCR循環(huán)數(shù)計算方法：

（1）繪制熒光強度與循環(huán)數(shù)的線性關系圖；

（2）最大熒光減去最小熒光，得到熒光強度差；

（3）1/4熒光強度差加上最小熒光強度，得到下熒光；1/3熒光強度差加上最小熒光，得到上熒光；

（4）計算下熒光及下熒光對應的循環(huán)數(shù)。

17. 將剩余步驟9中的45 ul PCR產物放回PCR儀中繼續(xù)反應：

PCR程序：

18. 用Qiagen MinElute PCR純化試劑盒純化擴增文庫；使用20μl EB洗脫。

19. 凝膠分離和純化：

將純化后的PCR產物裝在2%的EX凝膠上，不加染料，運行6分鐘，標記凝膠，采用Qubit收集除60bp primer外的所有產物；膠回收，用EB緩沖液洗脫20ul。

20. 用Qubit測定DNA濃度。

21. 生物分析儀

采用生物分析儀檢測樣品，大小約150-1000bp之間，記錄平均大小、濃度（pg/ul）和摩爾濃度（nmol/l）。用于與后續(xù)測序結果匹配（檢查峰值形狀是否與測序數(shù)據(jù)相關）。

怎么樣，是不是很簡單呢？快來試一試吧！