PyMOL教程
本文將會介紹如何利用PyMOL軟件進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疊加，這一技巧在對比未結(jié)合抑制劑的酶與結(jié)合了抑制劑的酶時尤為關(guān)鍵。
通過這種方法，我們可以細致地觀察并分析結(jié)構(gòu)上的變化。如果蛋白質(zhì)經(jīng)歷了顯著的構(gòu)象變化，我們還可以利用疊加技術(shù)，精確測量并比較各組成部分的位置移動，從而深入理解這些變化對蛋白質(zhì)功能的影響。
01 加載與查看NMR結(jié)構(gòu)
NMR（核磁共振）結(jié)構(gòu)因其能夠展示蛋白質(zhì)的多種動態(tài)構(gòu)象而備受青睞。以PDB編號2k39的泛素NMR結(jié)構(gòu)為例，我們可以通過在命令行輸入fetch 2k39來加載這個結(jié)構(gòu)。
泛素是一種在真核生物中參與多種過程的調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與其他蛋白質(zhì)共價結(jié)合，導(dǎo)致它們發(fā)生構(gòu)象變化，被標記為蛋白酶分解，以及其他多種作用。
02 NMR結(jié)構(gòu)的動態(tài)展示
這個編號為2k39的NMR結(jié)構(gòu)具有116種不同的狀態(tài)，展現(xiàn)了泛素的多種構(gòu)象。如果我們想一次查看一個構(gòu)象，可以點擊切換按鈕來手動查看這些構(gòu)象的變化，也可以通過在命令行中輸入mplay來自動播放這些構(gòu)象，讓蛋白質(zhì)在多種狀態(tài)之間快速切換，以便更直觀地體驗蛋白質(zhì)的動態(tài)性。
如果覺得播放速度太快的話，我們可以在菜單欄中選擇“Movie”→“Frame Rate”→“5 FPS”，讓它播放得更慢一些。這樣，我們就可以更清楚地看到泛素的靈活性，以及α螺旋是如何移動的。
如果要停止播放，我們可以在命令行輸入mstop或者按下停止按鈕。
03 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疊加案例
比較未結(jié)合抑制劑的酶與結(jié)合了抑制劑的酶
3.1 加載結(jié)構(gòu)
我們通過在命令行中輸入fetch 1J74、fetch 1D3Z和fetch 2GMI，加載可以疊加的結(jié)構(gòu)。
PDB編號為1J74的蛋白質(zhì)是一種酶，它參與了將泛素共價連接到其他蛋白質(zhì)的生物過程，這是泛素化過程的第二階段。為了比較這些結(jié)構(gòu)并找出任何可能的重大變化，我們可以使用super命令。
3.2 執(zhí)行疊加命令
通過在命令行中輸入super 1D3Z,2GMI和super 1J74,2GMI，我們可以看到所有結(jié)構(gòu)都已經(jīng)對齊。
為了確保2GMI始終作為參照點，我們兩次使用super命令時都需要將其作為最后一個輸入的PDB ID，這樣其他所有結(jié)構(gòu)都將相對于2GMI進行疊加。這樣做可以讓我們清晰地比較其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與2GMI結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的差異和變化。
3.3 隱藏非相關(guān)部分
我們可以通過點擊菜單欄“Display”→“Sequence”來顯示蛋白質(zhì)的序列。在查看序列時，我們可以把不屬于疊加的部分隱藏起來，這樣不會干擾我們的觀察。
首先按下Shift鍵選擇整個A鏈，接著我們選擇面板中新增欄目“sele”,點擊“A”標簽下的“rename selection”來重命名該欄目，直接刪除“sele”并輸入“unaligned”然后按回車鍵即可。
通過單擊“unaligned”欄目“H”標簽下的“everything”，我們就可以單獨隱藏整個A鏈。
3.4 觀察結(jié)構(gòu)
如果我們想更詳細地觀察某個部分，可以單擊“1D3Z”欄目“A”標簽下的“zoom”來放大到與泛素結(jié)合的區(qū)域。
通過點擊播放或者切換按鈕，我們可以觀察蛋白質(zhì)的動態(tài)情況，看看哪一個構(gòu)象與2GMI結(jié)構(gòu)對齊得最好。綜合觀察后，我們發(fā)現(xiàn)狀態(tài)5與2GMI的結(jié)構(gòu)非常匹配。
在觀察過程中，我注意到了一些細微的差異。例如，在某些部分，綠色結(jié)構(gòu)的有序性比粉色結(jié)構(gòu)更高。雖然環(huán)（loops）的靈活性較高且在不同結(jié)構(gòu)中可能有所不同，但二級結(jié)構(gòu)元素（如α螺旋??和β折疊??）是相當(dāng)明確的，并且對于對齊來說更為重要。因為環(huán)非常靈活且在不同實驗條件下可能呈現(xiàn)不同構(gòu)象，所以在給定的NMR結(jié)構(gòu)中，我們無法確定它們的確切位置。
04 去泛素化酶的結(jié)構(gòu)疊加
在super命令不起作用時可以參考這個案例進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疊加。
4.1 加載結(jié)構(gòu)
我們在命令行中輸入fetch 1D3Z、fetch 1NB8和fetch 1NBF，獲取相同的泛素結(jié)構(gòu)。1NB8和1NBF都是去泛素化酶，其中1NB8具有從其他蛋白質(zhì)上去除泛素的功能，而1NBF則作為與1NB8進行對比的對象。
4.2 執(zhí)行疊加命令
我們的目標是將1NB8與1NBF進行結(jié)構(gòu)對齊。我們可以先放大視圖，仔細觀察泛素部分的對齊情況。通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)泛素部分的對齊效果很不錯，這為我們接下來的疊加操作提供了良好的基礎(chǔ)。
通過在命令行中輸入super 1D3Z,1NBF和super 1NB8,1NBF，我們將未結(jié)合泛素的1NB8與結(jié)合了泛素的1NBF進行疊加。
4.3 觀察結(jié)構(gòu)并驗證序列對齊
通過觀察對齊結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)1NB8與1NBF的整體結(jié)構(gòu)對齊效果非常好。然而，我們也注意到了一些細微的差異。例如，在1NB8中，存在一個α螺旋，而在1NBF中該位置并沒有對應(yīng)的α螺旋；同時，它們的β折疊結(jié)構(gòu)也有些交織在一起。
這是一個好的跡象，說明我們可以繼續(xù)檢查序列，確保它們來自同一生物體并且序列相同。我們可以通過菜單欄中的“Display”→“Sequence”選項來展示序列對齊。經(jīng)過檢查，我們發(fā)現(xiàn)大部分序列與參考序列的對齊結(jié)果非常吻合。
如果在嘗試使用PyMOL對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行疊加時遇到問題，可能是因為蛋白質(zhì)之間存在較大的構(gòu)象變化，這導(dǎo)致自動化對齊工具難以正確匹配結(jié)構(gòu)。這種困難可能是因為軟件在對齊過程中選擇了蛋白質(zhì)的不同部分作為參照點，尤其是當(dāng)這些部分在結(jié)合和未結(jié)合抑制劑時變化顯著。
例如，我們注意到1NBF的結(jié)構(gòu)比1NB8的結(jié)構(gòu)復(fù)雜得多，這可能是對齊困難的原因之一。1NBF較大的結(jié)構(gòu)意味著有更多的原子和可能的空間結(jié)構(gòu)變化，這增加了自動化對齊工具處理的復(fù)雜性。因此，在這種情況下，可能需要手動選擇特定的蛋白質(zhì)區(qū)域進行精確對齊。
4.4 再次執(zhí)行疊加命令
為了解決蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對齊中遇到的挑戰(zhàn)，例如由于構(gòu)象變化或殘基缺失導(dǎo)致的問題，我們可以在PyMOL中創(chuàng)建特定的選擇集來更精確地控制分析過程。
首先，我們按住Shift鍵選擇鏈A，將視序列圖滾動到那些在晶體結(jié)構(gòu)中無法觀察到的殘基部分，這些殘基雖然理論上應(yīng)該存在，但由于各種原因在晶體結(jié)構(gòu)的電子密度圖中未能顯示出來。
接下來我們可以看到面板中新增了欄目“sele”，點擊該欄目“A”標簽下的“rename selection”，將欄目重新命名為“1nb8sele”。同樣的方法，我們再給1NBF創(chuàng)建一個選擇集，并命名為“1nbfsele”。
通過這種方式，我們可以專注于結(jié)構(gòu)中那些已知或被預(yù)測為重要的區(qū)域，并在對齊過程中排除或特別處理那些缺失殘基的部分，從而提高對齊的準確性和可靠性。
現(xiàn)在，通過在命令行中輸入super 1nb8sele,1nbfsele，我們可以看到，許多之前沒有對齊的部分現(xiàn)在都已經(jīng)對齊了，下一步就是處理那些沒有對齊的部分。
4.5 隱藏非相關(guān)部分
我們可以點擊未對齊結(jié)構(gòu)中的一個殘基，它會在序列中高亮顯示，然后我們滾動查看序列，這樣就可以確定正在查看的是哪條鏈。通過這種方式，我們可以精確地選擇并隱藏整個鏈，或者選擇并隱藏另一條鏈的特定部分。
按照上面的方法，我們按住Shift鍵，選擇1NB8（藍色）B鏈的起始殘基到最后的水分子。這時在面板中新增一個名為“Sele”的欄目。單擊“sele”欄目“H”標簽下的“everything”可以隱藏所有非相關(guān)部分。
依據(jù)此步驟，我們把1NBF（紅色）結(jié)構(gòu)未對齊的E鏈、B鏈和C鏈也都隱藏了起來。完成了初步的步驟后，我們在命令行中輸入hide nonbonded，隱藏水分子和非鍵合原子，以便更清晰地聚焦于這個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
4.6 活性位點建模
根據(jù)文獻，活性位點殘基是組氨酸H464和H1622。因此，我們需要在1NB8的A鏈中定位這些殘基，并在蛋白質(zhì)A鏈中為它們分別創(chuàng)建選擇集。
首先，我們回到1NB8的A鏈，找到H1622。接著，我們滾動序列找到H464。在這里，我們可以看到面板中新增了名為“Sele”的欄目，這兩個殘基被高亮標記出來，我們將這個欄目命名為“active1nb8”。接下來，我們對1NBF蛋白質(zhì)重復(fù)相同的步驟。
接著，我們點擊“active1nb8”欄目“A”標簽下的“zoom”，來放大這些殘基，以便更仔細地觀察。為了更清晰地看到它們的結(jié)構(gòu)，我們點擊“active1nb8”和“active1nbf”欄目“S”標簽下的“sticks”選項，以棒狀形式展示每一個殘基。
4.7 測量殘基的位移量
當(dāng)我們觀察這些活性位點殘基時，會發(fā)現(xiàn)它們在結(jié)合泛素后發(fā)生了顯著的位移。測量單個殘基的位移量對于了解催化殘基之間的距離變化非常有用。在這個蛋白質(zhì)中，我們可以看到在未結(jié)合泛素時，這些殘基相隔很遠，但一旦結(jié)合泛素，它們就被拉近了很多。
為了更具體地了解這種位移，我們可以單擊菜單欄“Wizard”→“Measurement”，來測量這些氮原子之間的距離。
通過這種方式，我們發(fā)現(xiàn)某個殘基在結(jié)合泛素后發(fā)生了2.8?的位移。
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