1.下載ref：https://github.com/ZhengXia/dapars/releases

2.github主頁：https://github.com/ZhengXia/dapars

3.說明書：DaPars: Dynamitic analysis of Alternative PolyAdenylation from RNA-seq — DaPars_Documents 0.9.1 documentation

4.dapars的谷歌論壇：https://groups.google.com/forum/#!forum/DaPars

使用：

py2.7環(huán)境下：

refbed=/media/pc/disk1/sun/refdata/ensembl_GRCm38/mm10.gencode-vm18.compre.fine.bed

genesymbol=/media/pc/disk1/sun/refdata/ensembl_GRCm38/Dapars_gene.symbol

python /home/pc/biosoft/dapars/src/DaPars_Extract_Anno.py -b $refbed -s $genesymbol -o Dapars_extracted_3UTR.bed

遇到一個問題，困擾了好久，最后發(fā)現(xiàn)是genesymbol的問題，分隔符！

出錯

解決后OK

和案例對比

下面尋找APA用的第一個方法：

'/home/pc/biosoft/APAtrap/predictAPA' -i OHT1.sorted.bedgraph OHT2.sorted.b edgraph DMSO1.sorted.bedgraph DMSO2.sorted.bedgraph -g 2 -n 2 2 -u Dapars_extracted_3UTR.bed -o APAtrap-UTR_Daprars_APA.txt

就是銜接APAtrap的第二步進行。

第二個方法：

python /home/pc/biosoft/dapars/src/DaPars_main.py configure_file

# configure_file:

Annotated_3UTR=Dapars_extracted_3UTR.bed

Group1_Tophat_aligned_Wig=OHT1.sorted.bedgraph,OHT2.sorted.bedgraph

Group2_Tophat_aligned_Wig=DMSO1.sorted.bedgraph,DMSO2.sorted.bedgraph

Output_directory=DaPars_APAresult/

Output_result_file=DaPars_APAresult

Num_least_in_group1=1

Num_least_in_group2=1

Coverage_cutoff=30

FDR_cutoff=0.05

PDUI_cutoff=0.5

Fold_change_cutoff=0.50

報錯了：

？？？

折騰了半天怪我沒好好看報錯信息：很明顯和rpy2有關(guān)！

再p2.7下安裝：

pip install rpy2 報錯顯示：rpy2已經(jīng)不支持低于py3的版本了。

那么py3.6下安裝rpy2卻又無法運行py腳本。

ref:rpy2的官方文檔：rpy2.readthedocs

最后是：pip install rpy2==1.8.4

在py2.7下運行：

python DaPars_main.py configure_file

需要把bedgraph轉(zhuǎn)換為bw文件：

ucsc下載：

wget http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bedGraphToBigWig

用法：

bedGraphToBigWig in.bedGraph chrom.sizes out.bw

下載size信息：

wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes

報錯：

chrMT is not found in chromosome sizes file

從MT處，構(gòu)建ensembl的fa的chrsize：

awk 'BEGIN{OFS="\t"}{print "chr"$1,$2}' Mus_musculus.GRCm38.dna_sm.toplevel.fa.fai > Mus_musculus.GRCm38.dna_sm.toplevel.fa.chr.size

運行bedgrph到bigwig：

bedGraphToBigWig OHT1.sorted.bedgraph Mus_musculus.GRCm38.dna_sm.toplevel.fa.chr.size OHT1.sorted.wig

報錯：bedgraph沒有sort

sort -k1,1 -k2,2n unsorted.bedGraph > sorted.bedGraph

再次運行bedgrph到bigwig：

bedGraphToBigWig OHT1.sorted.fine.bedgraph Mus_musculus.GRCm38.dna_sm.toplevel.fa.chr.size OHT1.wig

bigwig轉(zhuǎn)為wig：

下載ucsc：

wget ftp://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/bigWigToWig

用法：bigWigToWig in.bigWig out.wig

bigWigToWig?OHT1.bigwig?OHT1.wig

OK!

步驟

查看格式

igv中查看

用wig作為輸入后依然報錯：

看久了像是chr的問題

去除#

去除>chrGL等

sed -i '/^#/d' xxx.wig

sed -i '/^chrGL/d' xxx.wig

sed -i '/^chrJH/d' xxx.wig

sed -i '/^chrMT/d' xxx.wig

換的另一個方法生成的wig文件：還未試！

換用另一個方法生成的bedgraph：直接輸入

genomeCoverageBed -bga -ibam m6a/DMSO1.sorted.bam > DMSO1.bga.bedgraph

genomeCoverageBed -bga -ibam m6a/DMSO2.sorted.bam > DMSO2.bga.bedgraph

genomeCoverageBed -bga -ibam m6a/OHT1.sorted.bam > OHT1.bga.bedgraph

genomeCoverageBed -bga -ibam m6a/OHT2.sorted.bam > OHT2.bga.bedgraph

OK！

差別主要在于bedgraph是否是連貫的，中間沒有缺失，詳見：bamtobed/bedgraph

竟然?。?！

在py中用float可以讀進去

最最終結(jié)論：修改main的py腳本：第507行改為：int(float(fields[-1])) 即可。

坑死我了。

正常運行：

python raw_DaPars_main.py configure_file.txt

=======================================================

所以對于新安裝dapars的情況：

1.需要在py2.7下使用pip install rpy2==1.8.4安裝rpy2的低級版本

2.選擇bedtools的bam轉(zhuǎn)為bedgraph功能的-bga（和-split）模式

3.修改腳本507行增加float，匹配bedtools的浮點數(shù)輸出