一、前言

近日，美國圣母大學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)與開發(fā)中心的Brian Blagg教授在Angew上首次報道了Hsp90α選擇性抑制劑的發(fā)現(xiàn)。Blagg研究小組成員的主要目標是設(shè)計，合成和評估Hsp90蛋白折疊過程的新型抑制劑，已在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表多篇論文。

二、Hsp90α介紹

分子伴侶具有協(xié)助新生肽（客戶蛋白）的構(gòu)象成熟、復(fù)活變性蛋白等功能，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins , HSPs)是生物體在應(yīng)激狀態(tài)(病毒感染、缺氧、DNA損傷、高溫、癌細胞等)下誘導(dǎo)合成一組高度保守的蛋白，故又稱為應(yīng)激蛋白，廣泛存在于真核及原核生物中。根據(jù)同源程度及分子量大小，熱休克蛋白可分為Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小分子Hsp等幾個家族，它們具有廣泛的生物學(xué)功能，在細胞生長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、折疊、運輸、分解、細胞骨架功能等多方面發(fā)揮重要作用。Hsp90是研究最為廣泛的熱休克蛋白家族，在細胞內(nèi)含量豐富, 占細胞蛋白總量的1%～2%。在哺乳動物細胞中，Hsp90具有存在于細胞質(zhì)中的Hsp90α（誘導(dǎo)型）和Hsp90β（組成型）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（Grp94）、線粒體中的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1 (Trap1)四種亞型，具有不同功能（圖1）。

圖1 四種Hsp90亞型的結(jié)構(gòu)和功能

Hsp90單體主要由三個保守的結(jié)構(gòu)域組成：N端(N-terminal domain, NTD)結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合ATP或與輔助分子伴侶相互作用，緊連著富含電荷的可變長度連接區(qū)域；中間結(jié)構(gòu)域(Middle domain, MD)，含有客戶蛋白和輔助分子伴侶結(jié)合位點；C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)，其二聚化結(jié)構(gòu)域具有保守的五肽片段(MEEVD)，能夠錨定包含三角四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (tetratricopeptide repeat domain, TPR) 的輔助分子伴侶（圖1）。

NTD已成為Hsp90抑制劑的主要作用靶點，通過與Hsp90 NTD的 ATP結(jié)合位點競爭性結(jié)合，發(fā)揮Hsp90活性抑制作用。

三，首個Hsp90α選擇性抑制劑的發(fā)現(xiàn)

Hsp90負責超過300個客戶蛋白的構(gòu)象成熟，其中許多客戶蛋白是致癌轉(zhuǎn)化，生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，Hsp90已經(jīng)成為癌癥治療靶點而備受關(guān)注，目前已有18種Hsp90抑制劑處于臨床研究階段，但泛Hsp90抑制劑不可避免地產(chǎn)生某些副作用和毒性，阻礙了臨床研究進程，因此Hsp90亞型選擇性抑制劑的開發(fā)已經(jīng)成為重要的研究方向。Hsp90α亞型選擇性化合物的開發(fā)為剖析各亞型對相關(guān)疾病的作用和Hsp90泛抑制劑的毒性提供了新的工具和方法。

研究表明，敲除Hsp90α基因引起致癌客戶蛋白的降解，表明Hsp90α選擇性抑制劑能夠用于Hsp90α依賴性的癌癥治療。Hsp90α也能分泌到細胞外促進傷口愈合、細胞黏附和炎癥反應(yīng)。高侵襲性腫瘤細胞能夠分泌大量Hsp90α，激活基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)進而誘導(dǎo)MMP-3的表達，驅(qū)動腫瘤侵襲，因此開發(fā)Hsp90α選擇性抑制劑具有其獨特意義。

圖2 Radicicol，AT13387，化合物1，PU-H71，KUNB31的結(jié)構(gòu)

Hsp90α和Hsp90β亞型選擇性抑制劑的設(shè)計極具挑戰(zhàn)性，因為兩種亞型在N端ATP結(jié)合位點上的同源性大于95%，且在ATP的核苷酸結(jié)合位點上僅有52位和91位兩個氨基酸存在差異。在先前的研究中，通過分析Hsp90α和Hsp90β的N端ATP結(jié)合位點與根赤殼菌素(Radicicol)的相互作用模式，作者確定了Radicicol的間苯二酚部分與Hsp90α和Hsp90β分別具有獨特的相互作用，于是以間苯二酚衍生物類泛Hsp90抑制劑AT13387類似物1為先導(dǎo)化合物，首先，對化合物1與Hsp90α和Hsp90β的N-端ATP結(jié)合位點相互作用的計算分析表明，化合物1與Hsp90α的Ser52和Ile91形成了三個水分子介導(dǎo)的氫鍵，而化合物1與Hsp90β中的Ala52和Leu91形成了三個水分子介導(dǎo)的氫鍵，因此在Hsp90α的Ser52和Ile91周圍形成較小的親水口袋，而在Hsp90β的Ala52和Leu91周圍形成較大的疏水口袋。作者利用兩個結(jié)合位點之間的細微差異，設(shè)計并發(fā)現(xiàn)了第一個Hsp90β選擇性抑制劑KUNB31，但由于Hsp90α中的口袋更小，具有不利的空間位阻作用，因此沒能通過類似方式設(shè)計Hsp90α選擇性抑制劑。因此，Ser52/Ala52的差異是唯一能夠用于開發(fā)Hsp90α和β選擇性抑制劑的突破點(圖3C)。由于化合物1對Hsp90α和Hsp90β具有類似的親和性，因此同樣以化合物1為先導(dǎo)化合物進行Hsp90α選擇性抑制劑的設(shè)計。

圖3 化合物1與Hsp90α(A)和Hsp90β(B)的N端ATP結(jié)合位點相互作用及Hsp90α和Hsp90β的N-端ATP結(jié)合位點的氨基酸序列

進一步分析發(fā)現(xiàn)化合物1的間苯二酚部分通過苯環(huán)2位的酚羥基與Asp93發(fā)生氫鍵相互作用，4位酚羥基通過水分子A和B與Ser52形成氫鍵(圖3A,B)。因此，作者系統(tǒng)性地移除酚羥基以確定每個酚羥基對亞型結(jié)合的貢獻，于是設(shè)計了化合物2和化合物3(圖4)，并進行亞型選擇性評估。

圖4 化合物2和化合物3的結(jié)構(gòu)及其與Hspα的結(jié)合模式

結(jié)果表明，化合物3對Hsp90α的親和力是Hsp90β的大約10倍，而化合物2對Hsp90β的親和力約為Hsp90α的2倍，因此4位酚羥基對Hsp90α的結(jié)合更有利。

圖5 基于化合物1的構(gòu)效關(guān)系研究

基于以上結(jié)果，接下來，作者通過替換5位的異丙基以調(diào)節(jié)苯酚部分的空間環(huán)境和電子分布，并希望打開Hsp90的誘導(dǎo)型結(jié)合口袋 (圖6A)。當以Cl取代5-異丙基時導(dǎo)致親和力降低了大約10倍（4），而替換成碘則完全失去親和力（5）。在5位引入Br時，選擇性最高(大于30倍)且IC50值約為2.73 μM（6），引入-CF3時，可能由于氟和酚羥基的H形成分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致化合物7的親和力降低。當取代叔丁基時親和力與5相當，證明了球狀取代基能夠誘導(dǎo)Hsp90α選擇性的假設(shè)。

研究表明，Hsp90α的ATP結(jié)合位點上的位點1是一個誘導(dǎo)型口袋，當沒有結(jié)合配體或結(jié)合不合適配體時處于“Close”狀態(tài)(如配體化合物1)，當結(jié)合合適配體時(如嘌呤類配體PU-H71，格爾德霉素)，則誘導(dǎo)相關(guān)的氨基酸發(fā)生重排，形成新的結(jié)合通道，口袋處于“Open”狀態(tài)，其內(nèi)部具有較多疏水殘基，是一個疏水性口袋，該口袋對配體的亞型選擇性也可能具有重要作用(圖6)。于是作者設(shè)計化合物10、11和12以探索化合物與位點1的相互作用 (圖7)，同時這些化合物也縮短了4-苯酚部分與Ser52之間的距離以增加對Hsp90α的結(jié)合親和力及選擇性(圖5）。

圖6 PU-H71(A), AT13387 (B), 化合物12 (C)與Hsp90α的ATP結(jié)合口袋相互作用

結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物12與Hsp90α的結(jié)合親和力IC50約為4.8 μM，是Hsp90β的20倍以上。如圖6所示，PU-H71的亞甲二氧環(huán)誘導(dǎo)了位點1的打開(圖6A)。與能夠誘導(dǎo)位點1打開的泛Hsp90抑制劑PU-H71不同，化合物1能與位點1的關(guān)閉構(gòu)象結(jié)合(圖6B)。化合物12中5位的苯硫醚部分能夠靠近位點1，與PU-H71中到達開放構(gòu)象位點1的亞甲二氧基部分重疊(圖6C)。盡管在Hsp90α和β中都存在相同的位點1，但作者認為苯硫酚上的取代基能夠誘導(dǎo)Hsp90α的不同構(gòu)象，干擾4-苯酚與Ser52的相互作用。于是設(shè)計了系列取代苯硫醚類似物并進行Hsp90α的親和力測試，其中化合物12a和12b分別含有亞甲二氧環(huán)和亞乙基二氧環(huán)，作者猜測可能與Tyr139形成額外的氫鍵相互作用(圖8a)。

圖7 基于化合物12的構(gòu)效關(guān)系研究

結(jié)果表明，化合物12a和12b對Hsp90α的親和力確實提高。同樣，含有3,4-二甲氧基苯硫醚的化合物12c對Hsp90α的IC50約為530 nM，選擇性約為Hsp90β的22倍。苯硫醚環(huán)上不同位置取代甲基的結(jié)果表明，3位和4位取代能夠提高對Hsp90α的結(jié)合親和力。因此，在苯硫醚環(huán)的3位和4位進行取代設(shè)計了化合物12d、12e、12f和12g。其中12d和12e對Hsp90α的IC50分別為840 nM和720 nM，而三甲基取代的12f親和力降低。3-甲氧基-5-甲基取代的12g對Hsp90α的親和力約為900 nM。3-甲基變?yōu)?-乙基時親和力增加，而3-丙基取代時親和力降低。為了研究Hsp90α選擇性抑制劑與Hsp90α的結(jié)合模式，將化合物12b和12d與Hsp90α的N-端結(jié)構(gòu)域進行共晶研究。結(jié)果表明，化合物12b的乙二氧環(huán)通過保守的水分子與Tyr139相互作用，增加了結(jié)合力，而化合物12d不與Tyr139形成額外氫鍵作用，進一步證明了作者的假設(shè)。疏水性的占據(jù)位點1能夠通過減少熵罰而提高結(jié)合親和力，這可能是12h親和力增加的原因。同樣，4-苯酚通過水分子A和B與Ser52相互作用(圖4和9a,b)。因此，包含苯硫醚的化合物對Hsp90α的選擇性能夠通過非選擇性抑制劑化合物1和化合物12b與Hsp90α結(jié)合模式的重疊分析得到合理解釋。如圖9c所示，5位苯硫醚和4-苯酚的存在誘導(dǎo)Hsp90α構(gòu)象的改變，導(dǎo)致位點1開放。此外，硫醚片段的方向不同于嘌呤類Hsp90泛抑制劑(圖9d)。Hsp90α與12b和12d的共晶結(jié)構(gòu)表明，化合物能夠誘導(dǎo)4-苯酚靠近Ser52，引起硫醚向腺嘌呤結(jié)合口袋移動(圖9c)。因此，Hsp90α優(yōu)先結(jié)合含有4-苯酚的苯硫醚衍生物。

圖8 化合物12b(a)和12d(b)與Hsp90α的共晶結(jié)構(gòu)，化合物12b和1結(jié)合于Hsp90α的重疊共晶結(jié)構(gòu)(c)，化合物12b和PU-H71結(jié)合于Hsp90α的重疊共晶結(jié)構(gòu)(d)

利用化合物5和12d進行NCI-60癌細胞篩選，以確定Hsp90α選擇性抑制劑的細胞響應(yīng)。非小細胞肺癌細胞NCI-H522、黑色素瘤細胞UACC-62、卵巢癌細胞SK-OV-3和腎細胞癌細胞UO-31的生長被選擇性抑制。用高濃度的12h處理NCI-H522細胞，測定Hsp90客戶蛋白的降解情況，Hsp90客戶蛋白Her2、Raf-1和Akt的水平以劑量依賴性方式降低。與Hsp90α依賴性的客戶蛋白c-Src相比，Hsp90β依賴性的CDK4在更高濃度的12h時才會發(fā)生降解，表明在細胞內(nèi)化合物優(yōu)先抑制Hsp90α。Hsp90α依賴性的客戶蛋白生存素在12h處理時也呈劑量依賴性下降。與Hsp90泛抑制劑(如GDA)相比，Hsp70水平僅有低程度的誘導(dǎo)升高。低濃度的12h能夠誘導(dǎo) Hsp90水平升高，而高濃度時則降低。此外，高濃度12h處理時 HSF1水平也降低了(圖10)。

圖9 化合物12h處理后，利用Western blot 分析NCIH522細胞中客戶蛋白情況，陰性對照DMSO，陽性對照格爾德霉素(GDA, 500 nM)

蛋白或酶亞型選擇性抑制劑的設(shè)計和開發(fā)一直是藥物化學(xué)中最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一，亞型蛋白序列和構(gòu)象高度相似的情況下尤為如此。配體結(jié)合位點僅有兩種氨基酸差異的Hsp90α和Hsp90β亞型選擇性抑制劑的開發(fā)是藥物化學(xué)家面臨重要挑戰(zhàn)。先前研究利用兩種氨基酸的差異發(fā)現(xiàn)了Hsp90β選擇性抑制劑，但同樣的方法應(yīng)用于Hsp90α選擇性抑制劑的開發(fā)并沒有取得成功?；诟鞣N酚類化合物的作用分析獲得的新型先導(dǎo)化合物3對Hsp90α的選擇性約為Hsp90β的10倍?；诖?，作者通過基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計最終發(fā)現(xiàn)了首個Hsp90α選擇性抑制劑12h，其Hsp90α抑制IC50為460 nM，選擇性是Hsp90β的48倍，能夠選擇性抑制NCI篩選中多種癌細胞的生長。低濃度時，Hsp90α選擇性抑制劑能夠誘導(dǎo)Hsp90α依賴性的底物蛋白降解，不影響Hsp90β依賴性的客戶蛋白?？傊髡咭曰诮Y(jié)構(gòu)的設(shè)計策略發(fā)現(xiàn)了第一個Hsp90α選擇性抑制劑，為Hsp90亞型選擇性抑制劑的設(shè)計與開發(fā)提供了重要方向，具有重要意義。

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