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正文開始：

文章題目：Targeting EZH2 reactivates a breast cancer subtype-specific anti-metastatic transcriptional program

靶標(biāo)EZH2反激活乳腺癌特定亞型(Luminal B)的反擴(kuò)增性轉(zhuǎn)錄機(jī)制

來源：2018 Nature Communications DOI: 10.1038/s41467-018-04864-8

第一部分：詞句經(jīng)典

1. Emerging evidence has illustrated the importance of...
2. Breast cancer is comprised of a variety of disease entities bearing diverse pathological features, prognostic outcomes and metastatic behaviours
3. In an effort to unravel, xxx(method) has led to...xxx(result)
4. xxx has particularly (adj. ) outcome, partly due to ...
5. However, functional studies have failed to reach a consensus as to whether Ezh2 plays a causal role in driving disease or is merely a by-product of increased cellular proliferation
6. underscores the importance of ...
7. Given that..., in this study we investigated... To this end, we employed... to
8. To further establish that..., and to gain insight into...
9. The results demonstrated that...
10. To further support the concept that...
11. Considered together, these data suggest that...
12. Our interest in pursuing... was driven by...

第二部分：文章結(jié)構(gòu)

摘要前言：
表觀遺傳在腫瘤研究中意義重大，但是組蛋白修飾對(duì)于乳腺癌的發(fā)展作用機(jī)制尚不明確，另外組蛋白修飾過程在各個(gè)子型之間的發(fā)展差距沒有被充分論證。本文發(fā)現(xiàn)：通過基因或藥物靶向Ezh2，可以很大程度上抑制小鼠體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移。進(jìn)而研究了乳腺癌Luminal B子型的分子機(jī)制：甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2維持了H3K27me3(Trimethylation of lysine 27 on histone 3 )調(diào)控的FOXC1基因抑制，也因而抑制了FOXC1的反擴(kuò)增性轉(zhuǎn)錄體系，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞不斷擴(kuò)增。因此，尤其對(duì)于Lunimal B型患者而言，F(xiàn)OXC1表達(dá)量的增加有利于病情減弱，另外可以利用EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑來控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

搜集一些相關(guān)知識(shí)：
表觀遺傳 Epigenetics：非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA調(diào)控等，主要通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程的調(diào)控，影響其功能和特性。
【這里@基因叔叔講解的很好】

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下， 在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'C位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。
正常情況下，人類基因組“ 垃圾”序列【重復(fù)的、無翻譯RNA能力的DNA，占據(jù)全基因組的98%以上，詳細(xì)參考http://news.bioon.com/article/6702414.html】的CpG二核苷酸相對(duì)稀少，并且總是處于甲基化狀態(tài)，目前在其中已發(fā)現(xiàn)多處潛在癌癥病源；
基因組中大小為100—1000 bp 左右且富含CpG二核苷酸的CpG島處于未甲基化狀態(tài)的序列，與56% 的編碼基因相關(guān)。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類基因組CpG島約為28890個(gè)，大部分染色體每1 Mb就有5—15個(gè)CpG島，平均值為每Mb含10.5個(gè)CpG島，CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系， CpG島甲基化會(huì)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活

組蛋白全稱是“組織蛋白”， 是被DNA圍繞的核內(nèi)蛋白，他們共同形成染色質(zhì)。當(dāng)二者結(jié)合打開時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子會(huì)結(jié)合到DNA上，促進(jìn)表達(dá)；當(dāng)二者結(jié)合太緊密，不愿分離時(shí)，基因表達(dá)當(dāng)然就被抑制。影響二者結(jié)合能力的一個(gè)因素就是：翻譯后修飾(Post-translational modifications)會(huì)改變組蛋白本身結(jié)構(gòu)，包括蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。因此Chip-Seq就是為研究這類蛋白修飾而生的。

乳腺癌存在異質(zhì)性【一種遺傳性狀可以由多個(gè)不同的遺傳物質(zhì)改變所引起】，利用全轉(zhuǎn)錄組分析得到了至少五種分子亞型： Luminal A, Luminal B, HER2+, Basal-like breast cancer (BLBC) and Normal-like

Liminal A 腫瘤發(fā)展很慢，預(yù)后(prognosis:醫(yī)生預(yù)測(cè)病情的發(fā)展情況)最優(yōu)；
Liminal B比A發(fā)展快，預(yù)后次之；
Basal-like：這種類型多見于攜帶BRCA1 gene 突變的女性患者，尤其是年輕的非裔美國女性。目前機(jī)制不明
HER2+：比Luminal型發(fā)展更快，預(yù)后較差，但是利用藥物靶標(biāo)HER2 protein治療可行【有關(guān)的藥物如：Herceptin (chemical name: trastuzumab), Perjeta (chemical name: pertuzumab), Tykerb (chemical name: lapatinib), and Kadcyla (chemical name: T-DM1 or ado-trastuzumab emtansine)】
Normal-like：與Luminal A型相似，預(yù)后較好但還不如Lunimal A

本文研究類型為Lunimal B型（以下簡(jiǎn)稱B型）, 研究表明它比BLBC or HER2+ 中組蛋白甲基化H3K27me3更多，但是其中機(jī)理尚不明確。研究目標(biāo)是Ezh2在B型中的作用，研究方法是：從小鼠組織損傷，癌細(xì)胞擴(kuò)增到大規(guī)模癌細(xì)胞擴(kuò)散的幾個(gè)典型時(shí)期，通過移除Ezh2，看個(gè)體的生存情況。而后又研究了Ezh2與FOXC1的關(guān)系。FOXC1是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，他負(fù)責(zé)監(jiān)控基因是否不受調(diào)控地轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，在Ezh2為主要誘因的腫瘤中FOXC1是沉默的。對(duì)FOXC1的功能進(jìn)行進(jìn)一步說明，設(shè)置的對(duì)照就是：FOXC1受抑制以及反激活的FOXC1的樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞擴(kuò)增的范圍和數(shù)量在反激活的樣本中大大降低，只要癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移受到抑制，癌癥的致死率也會(huì)隨之降低。

結(jié)論：

1. Ablation of Ezh2 impairs tumour onset and metastasis.
   移除Ezh2基因可以減輕腫瘤形成與轉(zhuǎn)移。
   利用這個(gè)模型：Polyomavirus Middle T (PyVmT)-driven model ，可以基本擬合人體中腫瘤的發(fā)展。

   目前研究較多的轉(zhuǎn)基因小鼠模型有： ERBB2(erythroblast leukemia viral oncogene homolog2)、MMTV(murine mammary tumor virus)-ERBB2、 MMTV-PyMT(polyoma middle T antigen)、MMTV- wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型等

   • ERBB2基因編碼 ERBB2蛋白，屬于細(xì)胞生長因子受體家族，具有酪氨酸蛋白激酶活性，在20％～60％人類原發(fā)性乳腺癌的病例中有擴(kuò)增或過表達(dá)或者變異，導(dǎo)致異常活化，刺激細(xì)胞增殖、發(fā)育分化、遷移，與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后正相關(guān);
     ERBB2轉(zhuǎn)基因小鼠，主要是高表達(dá)ERBB基因同源(如ERBB2/ERBB2)或異源二聚體(如ERBB2/ERBB3)，這種異?；罨闹掳┗蛟隗w內(nèi)或乳腺組織高表達(dá)，導(dǎo)致小鼠發(fā)生乳腺癌等腫瘤
     • ERBB2的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生與預(yù)后相關(guān)，并與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)
   • MMTV是導(dǎo)致小鼠乳腺腫瘤的重要病毒，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型時(shí)，并不是利用其致癌特性，而是利用其病毒組織特異啟動(dòng)子及增強(qiáng)子功能，調(diào)控癌基因ERBB2、PyMT、wnt-1在小鼠乳腺高表達(dá)而發(fā)生乳腺癌.【用MMTV乳腺特異表達(dá)癌基因的轉(zhuǎn)基因乳腺癌模型較多用，尤其是 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因乳腺癌模型小鼠，該模型動(dòng)物第8周開始發(fā)病，第14周達(dá)到晚期乳腺癌的水平，表現(xiàn)出與人類乳腺癌較為相似的病理改變，也是目前研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制的理想模型】
     • MMTV- Wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病率穩(wěn)定，便于觀察乳腺腫瘤發(fā)展進(jìn)程的不同階段，是抗乳腺癌藥物研究和篩選的良好的動(dòng)物模型；
     • MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠利于觀察乳腺癌在小鼠不同周齡的發(fā)展情況，并且這個(gè)腫瘤模型轉(zhuǎn)移效率比較高，可以向肺部轉(zhuǎn)移；
     • MMTV-ERBB2轉(zhuǎn)基因小鼠是由小鼠活化的 ERBB2基因，以小鼠乳腺癌腫瘤病毒為載體，轉(zhuǎn)基因形成的乳腺癌動(dòng)物模型，是目前國際上作為乳腺癌病因?qū)W、預(yù)防研究的理想模型
   • 以上兩種方法不同，但是結(jié)果都使得致癌基因高表達(dá)，還有一種：抑癌基因敲除動(dòng)物模型發(fā)生乳腺癌，常用的模型有：敲除小鼠抑癌基因Tp53、敲除乳腺癌抑制基因(breast tumor suppressor gene,BRCA)包括BRCA1和BRCA2敲除模型，以及上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)與p53聯(lián)合缺陷動(dòng)物模型等

   有趣的是，缺少Ezh2的腫瘤細(xì)胞利用免疫熒光檢測(cè)腫瘤上皮組織中的H3K27me3，結(jié)果并檢測(cè)不到，說明Ezh1并不能代替Ezh2。
   另外，Ezh2的減少可以極大地降低腫瘤細(xì)胞向肺部的擴(kuò)散能力。

2. Pharmacological H3K27me3 inhibition mimics genetic ablation
   藥物(GSK-126)抑制H3K27me3甲基轉(zhuǎn)移酶模擬基因移除
   GSK-126調(diào)控的抑制作用可以借助H3K27me3的免疫組化分析

   免疫組化分析是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點(diǎn)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶、金屬離子、同位素等，顯示一定的顏色，并借助顯微鏡觀察其顏色的變化，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成份或化學(xué)性質(zhì)

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上面知道了GSk-126是作用于Ezh-2，那么對(duì)于腫瘤細(xì)胞能不能直接作用呢？為了進(jìn)一步驗(yàn)證GSK-126的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用是作用于腫瘤細(xì)胞，又選取了野生型（正常細(xì)胞）與Ezh2-null Tet-ON PyVmT 模型（腫瘤細(xì)胞但是其中的Ezh2無作用，排除了Esh2的影響），使用GSK-126處理后，野生型出現(xiàn)肺部擴(kuò)散但是Ezh2-null沒有?？紤]到Ezh2在腫瘤形成初期以及擴(kuò)散中都發(fā)揮了作用，而上面研究表明了GSK對(duì)擴(kuò)散抑制作用明顯，那么GSK-126能否對(duì)腫瘤在初期生長有作用呢？結(jié)果表明：GSK-126對(duì)腫瘤細(xì)胞初期生長作用不顯著。

3. Identification of a Foxc1-driven anti-metastatic cascade.
   鑒定抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程，想看看其中有哪些調(diào)控因子作用。其中最有研究?jī)r(jià)值的就是Forkhead Box C1, 因?yàn)樗瑫r(shí)出現(xiàn)在了多種鑒定分析中，并且在晚期腫瘤的Ezh2上游顯著調(diào)控。
   對(duì)腫瘤晚期的H3K27me3進(jìn)行了Chip-Seq分析，發(fā)現(xiàn)在Ezh2失活的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合降低，說明Ezh2能夠維持H3K27me3；再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)交叉分析，結(jié)果顯示：約22%的差異上調(diào)基因是H3K27me3靶標(biāo)因子，因此Ezh2可以間接調(diào)控這些基因。有趣的是，這些基因通過pathway富集分析，主要集中在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、組織形態(tài)產(chǎn)生等，其中就包括FOXC1。
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FOXC1也是個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，能夠獨(dú)自調(diào)控它的靶標(biāo)基因，從JASPAR數(shù)據(jù)庫得到了23個(gè)推測(cè)的FOXC1靶標(biāo)基因，在EZH2-null的樣本中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還表示了各個(gè)基因與H3K27me3結(jié)合位點(diǎn)的富集情況(a)：
又利用了GO數(shù)據(jù)庫找到了這些上調(diào)的FOXC1靶標(biāo)基因的下游通路(b)

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4. Functional validation of Foxc1 anti-metastatic capacity

   FOXC1下游有許多靶標(biāo)元件，能夠控制他們修復(fù)細(xì)胞的異?；顒?dòng)和擴(kuò)增。
   接下來就是FOXC1抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能鑒定，采用RNA干擾敲除PyVmT 細(xì)胞中的FOXC1，同時(shí)用GSK-126處理，結(jié)果基本完全恢復(fù)了GSK處理前的樣子，說明在抑制FOXC1會(huì)加速H3K27me3調(diào)控的基因沉默，加快腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。

5. Differential association of elevated FOXC1 across subtypes

   驗(yàn)證了EZH2和FOXC1之間的關(guān)系：測(cè)了20個(gè)B型病人FOXC1的mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，轉(zhuǎn)錄后蛋白水平EZH2和FOXC1負(fù)相關(guān)，因此佐證了B型中EZH2調(diào)控FOXC1表達(dá)抑制。
   各個(gè)亞型與FOXC1的關(guān)系是：高表達(dá)的FOXC1使得B型和HER2+型病人舊病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)降低，存活率提高；
   BLBC型沒有改善；A型存在很大的改善可能性

   因此總結(jié)為一句話：FOXC1 plays a tumour suppressive role in non-BLBC subtypes

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幾種亞型的EZH2與FOXC1表達(dá)量差異：這是抑制了Ezh2甲基轉(zhuǎn)移酶的活性后，各個(gè)類型腫瘤的擴(kuò)散能力，很明顯，只有在B型和HER2+型中高水平的EZH2表達(dá)量才對(duì)應(yīng)低水平的FOXC1；左圖中利用PAM50基因表達(dá)來分析確定腫瘤的固有亞型

6. EZH2-mediated metastasis suppression is Luminal B specific

總的來說，B型致癌基因(oncogene)EZH2作用途徑與被抑制途徑效果如圖：

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第三部分：總結(jié)

全文的核心就是分析一個(gè)機(jī)制： B型乳腺癌的致癌基因EZH2對(duì)于FOXC1基因的抑制調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散

這些發(fā)現(xiàn)臨床上可以用于EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的應(yīng)用，畢竟這個(gè)致癌基因還是廣泛存在的，所以醫(yī)療前景廣闊

FOXC1基因的作用也是至關(guān)重要，它的表達(dá)量升高，會(huì)顯著提高非BLBC亞型的預(yù)后效果，尤其對(duì)于B型會(huì)顯著抑制腫瘤擴(kuò)散【即存在亞型選擇性，很好的預(yù)后biomarker】，另外FOXC1的一些靶標(biāo)基因也能對(duì)A、B、HER2+型患者產(chǎn)生較好的預(yù)后，因此FOXC1的下游調(diào)控也對(duì)腫瘤存在抑制作用。在B型條件下，這些靶標(biāo)基因與神經(jīng)元的形成也有關(guān)系。

本文使用的試驗(yàn)方法：

orthotopic transplantation（原位移植）、ShRNA silencing 、Immunofluorescence 、Immunoblotting 、RNA isolation, cDNA synthesis and qRT-PCR 、Microarray data acquisition 、
Chromatin immunoprecipitation （Chip-Seq）

Chip-Seq 分析：
五種亞型構(gòu)建混池構(gòu)建DNA文庫，使用Illumina2000單端測(cè)序得到50bp的reads，下機(jī)得到的raw data先trim過濾（length \geq 32）,質(zhì)量值(phred\geq30) ,去接頭用的是fastx v0.0.13.1 。BWA比對(duì)到小鼠參考基因組mm10。MACS v1.4.1進(jìn)行peak calling（mfold = 10,30; bandwith = 300; p-value cutoff = 1E-5 ）。bedtools找peak列表交集，存在1個(gè)堿基的重疊就認(rèn)為binding peaks是overlapping的。注釋用的HOMER v3.18。

Data Availability：
Microarray and ChIP-Seq data sets have been deposited in the GEO database at NCBI. All data sets in this study are available under GEO108861 and GSE108899.

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